淋巴细胞转化概念免疫学试验·3.PPT

免疫学实验 ·*· T淋巴细胞转化试验 于彬 E-mail：yubin@jlu.edu.cn 淋巴细胞在体外培养时，受到刺激物的刺激后可表现为细胞体积增大、代谢旺盛、蛋白质和核酸合成增加，即向淋巴母细胞转化和增殖。此现象称为淋巴细胞转化现象（简称为淋转）。 淋巴细胞转化率的高低可以反映机体的免疫水平，因此可作为测定机体免疫功能的指标之一。 淋巴细胞转化概念 ·*· 检查患者细胞免疫功能 估计疾病的疗效及预后 细胞配型抗原的检查：移植免疫 免疫药理学：具有免疫调节的药物、保健品、中草药及生物制品 卫生毒理学的研究 淋巴细胞转化实验的应用 ·*· 实验分组及材料 实验原理 主要操作步骤 检测方法 实验主要内容 ·*· 实验分组及材料 器材 75%酒精 若干 无菌纱网 1块/组 无菌平皿 1块/组 无菌96孔培养板 1块/组 细胞计数板 1套/组 显微镜 1台/组 可调微量加样器 1套/4人 无菌吸头（大、中、小）1套/4人 EP管 25个/4人 眼科剪、小镊子 1饭盒/4人 5ml注射器 1个/组 100ml烧杯 1个/组 细胞培养箱（37℃ 5%CO2) 酶标仪 1台 离心机 2个/room 超净台 2个/room 分组：每组4人 动物及试剂 小鼠 1只/组 培养液(1640) 无FCS 10ml/组 培养液(1640)10%FCS 10ml/组 50ml灭菌离心筒 1个/组 ConA(200ug/ml) 200ul/组 MTT（5mg/ml) 　　　 0.7ml/组 滤纸 一块 二甲亚砜（DMSO) 3ml/组 ·*· Lymphocytes(B/T) mitogens Specificity Ag Proliferation transformation lymphoblast Nucleic Acid↑ Protein ↑ T细胞、B细胞表面具有识别抗原的受体和有丝分裂原受体， 在特异性抗原刺激下可使相应淋巴细胞克隆发生增殖。 原 理 ·*· 有丝分裂原（mitogen）来自植物蛋白或细菌产物，它能与多种细胞膜糖类及寡糖基分子结合，后者为丝分裂原受体、结合后能促使细胞活化和诱导细胞分裂。 T和B细胞表面都有丝裂原受体，在体外可非特异性刺激静止淋巴细胞向淋巴母细胞转化。这种转化细胞DNA合成增加，出现细胞体积增大，胞浆增多，嗜碱性以及产生有丝分裂等形态变化。 有丝分裂原 ·*· T cell proliferation 植物血凝素（phytohemagglutinin, PHA)(人T） 刀豆素A（concanavalin, ConA）（鼠T） 美洲商陆（pokeweed mitogen, PWM) B cell proliferation 脂多糖（lipopolysaccharide, LPS)(鼠B） 金黄色葡萄球菌A蛋白（staphylococcal protein A,SPA)（人B） 美洲商陆（pokeweed mitogen, PWM) 常用的丝裂原 ·*· 形态学观察法 3H-TdR（3H-胸腺嘧啶核苷）掺入法 MTT法 (四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法） 本次实验采用 MTT法 常用的检测方法 ·*· 淋巴母细胞主要表现有体积明显增大，是成熟淋巴细胞的3~4倍；染色质疏松，核仁清晰可见；胞浆丰富并形成空泡。 根据细胞的大小，核与胞浆的比例，胞浆的染色性和核结构以及有无核仁等特征，分别计数淋巴母细胞、过渡型母细胞和核丝分裂相细胞以及成熟的小淋巴细胞，以前三者为转化细胞，每份标本计数200个细胞，按下式计算转化率： 形态学检测方法 ·*· G0 G1 有丝分裂原 特异性抗原 S Pr,RNA,DNA 前体物质 DNA↑↑ New DNA 3H-TdR TdR 3H-TdR cpm 3H-TdR掺入法 ·*· T细胞在PHA或ConA刺激下转化为淋巴母细胞，同时DNA和RNA合成明显增加，此时将同位素3H标记的胸腺嘧啶核苷（ 3H-TdR ），加入培养液内，则被作为DNA原料摄入到转化的细胞内，测定细胞内掺入DNA中的3H-TdR的放射性相对