水稻端粒酶活性定量分析研究.pdf

中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００７，２７（５）：４５～４９ 水稻端粒酶活性定量分析研究  刘小川 　梁永恒　陈　波 （浙江理工大学生物工程研究所　杭州　３１００１８） 摘要　端粒酶活性直接与细胞的分生能力、生活力、生命力有着密不可分的关系，因此对其活性 测定有着重要意义。参照人类端粒酶体外检测的原理和方法，设计了特别的先导引物和反向引 物，采用不同的退火温度将ＰＣＲ循环分成两步进行，再结合ＤＮＡ凝胶电泳成像定量分析系统，以 模式植物水稻为研究对象，对端粒酶活性定量检测方法和反应条件进行了探索。结果显示，水稻 端粒酶活性的最佳反应条件为：温度１９℃，反应时间１３分钟，总蛋白浓度０．２８ｇ／ｌ，与人端粒酶 μ μ 最佳反应条件有明显差异，建立了一种有效测定植物端粒酶活性的定量检测方法。应用该方法 对６个水稻品种的根、幼叶及幼穗３个不同组织器官的端粒酶活性进行了定量测定，结果显示幼 穗最高，其次为幼叶，根最弱。说明植物端粒酶活性与细胞、组织的生活力有着密切关系。 关键词　端粒酶　细胞生活力　定量测定　水稻 中图分类号　Ｑ９４２ 　　端粒酶是保证染色体末端结构稳定，维持细胞正 物的ＤＮＡ结合于端粒酶的两个位点：一是位于端粒酶 常分裂的重要生物酶。在胚性细胞等增值活跃的细胞 组分的蛋白质上的锚定位点，另一个是互补于ＲＮＡ模 中都具有端粒酶活性，绝大多数的肿瘤细胞、癌细胞也 板区的模板位点。锚定位点的结合避免了在易位和延 具有端粒酶活性，在正常体细胞中还未检测到 ［１，２］。它 伸过程中的脱离。Ｇ链延伸同时，Ｃ链由特殊的ＤＮＡ 是一种具有逆转录活性的核糖核蛋白，除具有构成酶 ［６］ 聚合酶复制 ，从而维持了细胞分裂过程中染色体末 结构的蛋白质亚基外，还含有延伸ＤＮＡ末端所必须的 ［７］ 端的相对稳定性 。近年来，研究发现端粒酶的活性 ［３］ ＲＮＡ结构，这两部分对其作用的发挥都必不可少 。 与癌细胞的发生有密切的联系，引起了医学界的普遍 其中端粒ＲＮＡ亚基已经从原生动物、酵母、多种脊椎 关注，开展了大量基础研究，并取得了较大进展［８～１０］。 动物和人类中得到了克隆，而且其序列及长度在这些 然而对植物端粒酶的研究，尤其是对作物端粒酶活性 物种之间不具相似性［４］，端粒重复序列合成的模板为 的研究较少［１１］，其原因是缺乏有效的、简易的端粒酶活 含有８～３０个核苷的ＲＮＡ序列，该ＲＮＡ在细胞中的拷 ［１２］ 性测定方法，本文参照人类端粒酶活性体外检测法 ， ［５］ 贝数为１．２～１，９个 。虽然端粒酶的反转录酶亚基 结合ＤＮＡ凝胶电泳成像定量分析系统，就水稻端粒酶 ［４，５］ 基因已经从拟南芥中得到克隆 ，但在高等植物中至 活性定量检测方法进行了探索，获得了理想的结果。 今还没有克隆到，推测它与脊椎动物的ＲＮＡ亚基结构 有显著差异。 １　材料与方法 　　端粒酶以富含 Ｇ的染色体末端３′ＯＨ为引物，以 １．１　实验材料 其自身携带的ＲＮＡ为模板合成串联重复的ＴＴＴＡＧＧＧ。 　　采用杂交水稻亲本“Ｊ４１３”，“９３０８”，“明恢