CRMP鄄1真核表达载体的构建及其突起生长抑制作用.PDF

生物化学与生物物理进展 Progress in Biochemistry and Biop hys ics 2009, 36(3): 297~304 CRMP 1 真核表达载体的构建 及其突起生长抑制作用* 1)** 1) 2) 1) 2)** 郭国庆 辛 莉 邱小忠 沈伟哉 原 林 1) 2) ( 暨南大学医学院解剖学教研室，广州5 10630； 南方医科大学临床解剖学研究所，广东省组织构建与检测重点实验室，广州 510515) 摘要 为研究坍塌反应调节蛋白-1(collapsin response mediator protein-1，CRMP- 1)对神经元突起生长的作用，构建了CRMP-1 真核表达载体，以神经生长因子(NGF)诱导的PC 12 细胞为模型，采用基因转染、突起生长时差成像、突起提取和免疫印迹 技术进行观察 结果显示，NGF 诱导的PC 12 细胞具有典型的神经元形态特征，脂质体转染技术可成功地把CRMP-1 基因导 入细胞 过表达CRMP-1 可明显抑制突起生长，促进突起坍塌，首先是细小突起缩短，然后是长突起，细胞突起的长度随 CRMP-1 蛋白表达时间延长呈逐渐缩短的趋势 突起提取液的测定显示，CRMP-1 过表达的细胞较NGF 诱导的和转染空载体 的细胞突起明显减少(P 0.01) 说明CRMP-1 有明显的突起生长抑制作用 关键词 坍塌反应调节蛋白，神经元，突起，生长，基因转染，基因表达 学科分类号 Q189，Q954.67，R329.2 DOI: 10.3724/SP.J.1206.2008.00504 坍塌反应调节蛋白(collapsin response mediator 用，本实验构建CRMP-1 的真核表达载体，并用 proteins，CRMPs)在神经系统中丰富表达，尤其是 神经生长因子(NGF)诱导PC12 细胞分化为神经元 发育阶段的神经组织，并作为Rho GTPases 的下游 样细胞，脂质体转染后通过绿色荧光蛋白示踪观察 信号和作用底物，介导突起生长和坍塌，其靶向结 CRMP-1 的突起生长抑制作用 构是细胞骨架蛋白，如微管、肌动蛋白，通过细胞 1 材料与方法 骨架的聚 和解聚参与突起生长的调控，以调控神 经元的生长行为[1～3] CRMP-1 是CRMPs 家族成员 1援1 材料 之一，1996 年被克隆并鉴定，CRMP-1 可与 1援1援1 菌株和质粒 E coli Competent cells DH5 Sema 3A 的受体Plexin A1 组成复 体改变COS7 购自TaKaRa 公司；PGEM-T Easy 克隆载体购自 [4] Invitrogen 公司；phrGFP 域-N 表达载体购 自 细胞的形态 ，其突变体减弱Sema 3A 诱导的背根 [5] Stratagene 公司 神经节细胞轴突的排斥作用 CRMP-1 沿着细胞 试剂 250 DNA ladder marker， R 限制 内微管进行分布，参与突起生长、细胞变形和肿瘤 1援1援2 Eco 玉 侵袭迁移过程[6, 7] 突起生长是神经元发育过程中 性内切酶，MiniBEST Plasmid Purification Kit 2.0， 的重要事件，也是神经网络形成和建立的必