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160 中国草食动物 2006年 不同冷冻和解冻方法对绵羊卵母细胞发育效果的影响 刘丑生1，周佰成2，王志刚1，赵有璋2，赵俊金1，孟飞1 (1．全国畜牧兽医总站畜禽牧草种质资源保存利用中心，北京100094； 2．甘肃农业大学动物科技学院) 摘要：卵母细胞冷冻保存具有广泛而潜在的应用价值。试验主要分析了不同冷冻及解冻方法对绵羊GV期和MII卵母细 胞发育效果的影响。GV期卵母细胞程序化冷冻解冻后形态正常率(54．8％)以及体外培养成熟率(14．7％)均显著低于细 法冷冻不同发育时期卵母细胞成熟率和卵裂率与对照组相比较均差异极显著(PO．01)。解冻后卵母细胞形态正常率三 0．05)。 关键词：卵母细胞f冷冻；解冻；发育能力；绵羊 卵母细胞的冷冻保存要比胚胎的应用前景更加广泛．可以 液中保存，在2～4小时内运到实验室。卵巢保存液为：0．9％灭 利用冷冻技术建立卵子库，这样不仅可以解决目前卵母细胞来 菌生理盐水+100u／ml青霉素+100 ug／ml链霉素。 源短缺的问题，还可以使其它生物技术，如体外受精、体细胞克 实验所用试剂除特别注明外都为Sigma公司产品。 隆和转基因动物生产等技术不受时问和空间的限制。并且可以 1．2 实验方法 代替家畜的活体保种和濒危动物遗传种质资源保存。在人类医 1．2．1卵母细胞的采集在无菌条件下．用灭菌生理盐水洗涤 学上，卵母细胞冷冻保存将会为那些由于病理或其他原因而造 卵巢3～5次，盛于大烧杯中。用带12号针头的5ml注射器吸 成不孕的病人提供一个挽救生育的机会，还可以与干细胞结合 取少量采卵液，采卵渡为：mPBS(Gibeo)+5u／ml肝素+z％ 起来，为人类自身提供器官。在不久的将来，卵子冷冻技术将会 FCS(Hyclone)，然后抽吸卵巢表面2～6mm卵泡中的卵泡液， 进一步完善和规范化。使其与其他胚胎生物技术相结合．必将为 将抽取的卵泡液收集于表面皿中。静止后，在体视显微镜下观察 畜牧业生产和发展、生物技术以及人类医学等领域取得新的突 卵丘一卵母细胞复合体(COCs)，选取至少包有3层卵丘细胞且 破。 细胞质均匀的卵母细胞随机分组进行实验。 卵母细胞的冷冻和解冻方法主要是在参考胚胎冷冻方法上 1．2．2卵母细胞冷冻保存 建立起来的。近年来随着冷冻方法研究的不断深入，玻璃化冷 1．2．2．1程序化冷冻卵母细胞处理分3步进行．分别在0．5 M、1．0M、1．5VM 冻法越来越多地运用于各种哺乳动物卵母细胞的冷冻保存研究 EG冷冻处理液中处理5分钟后分3段装入 0．25 ml细管中，各段之间用空气隔开，每管装15～20枚卵母细 中。自从Vajta(1998)采用OPS玻璃化冷冻牛卵母细胞并产 胞，用塞子封口。然后放入程序化冷冻仪后以1℃／rain从室温 仔以来，各种快速和超快速玻璃化冷冻方法广泛运用到卵母细 胞冷冻保存研究中，主要有OPS玻璃化冷冻法、开放式毛细玻 -30℃．将细管投入液氮保存。 管法(GMP)、低温冷冻环法(Cryo_loop)、微滴法等。解冻方法 解冻时将冷冻细管从液氮中取出．在空气中停留lO秒后． 目前在卵母细胞上较冷冻方法的研究而言较少，主要采用梯度