黄杆菌肝素酶I双标签表达载体的构建及原核表达的研究.pdfVIP

摘 要 摘 要 肝素酶 Ⅰ(Heparinase, Hep I)是一类作用于肝素类糖胺聚糖 （glycosaminoglycan ， GAG ）主链糖苷键的多糖裂解酶，可用于低分子量肝素的制备、肝素类物质结构的解析 及体外血液循环中残存肝素的清除。2008 年的肝素钠事件对肝素类药物的安全性提出了 更高的要求，因此需要严格控制LMWH 制备过程中工具酶Hep Ⅰ的纯度，此外高纯度 的 Hep Ⅰ也更有利于后续对酶的晶体结构进行研究。本文拟通过分子克隆手段构建在 Hep Ⅰ基因上游携带GST-His 双标签的重组表达载体pGEX-His-Hep Ⅰ，以期获得高表达 量和高纯度的Hep Ⅰ，为制备高安全性的LMWH 和Hep Ⅰ晶体结构的解析奠定了基础。 以pET15b-Hep Ⅰ为模板，通过PCR 技术扩增出上游携带6 ×His 标签的Heparinase Ⅰ基因，与pMD-19T simple vector 连接后，成功构建了重组克隆质粒pMD-19T-His-Hep Ⅰ。经PCR 、双酶切和测序鉴定后，用限制性内切酶Bam H I 和Sal I 双酶切重组克隆 质粒pMD-19T-His-Hep Ⅰ和表达载体pGEX-4T-1，构建重组表达质粒pGEX-4T-1-His-Hep Ⅰ。对重组表达质粒pGEX-4T-1-His-Hep Ⅰ进行PCR 、双酶切，条带大小与理论值相符， 且测序结果显示与设计序列完全一致。 在含有100 mL LB 培养基的500 mL 摇瓶中，采用单因素方法对重组工程菌的最佳 培养条件和诱导条件进行摸索，所得最佳摇瓶发酵诱导条件为：发酵液初始pH 7.4 ，500 mL 摇瓶装液量80 mL，二级种子液接种量为2%条件下，37℃培养6 h （OD600 为1.6） 时添加0.8 mmol/L 的IPTG，22 ℃诱8 h，重组工程菌的菌体生长量DCW 值和产酶水平 均相对较高，分别为0.973 g/L 和418.63 IU/L 。在摇瓶优化的基础上，考察重组工程菌 在5 L 发酵罐中的高密度发酵情况。5 L 发酵罐中对诱导时机和碳源进行了优化的结果 表明：以甘油为碳源在菌体生长的对数中期诱导，更有利于GST-His-Hep Ⅰ融合蛋白的 4 表达，菌体生长量OD600 值和粗酶液活性分别为122.14 和1.697×10 IU/L 。 上清液经GSTrap FF 和HisTrap HP 柱两步亲和纯化，所得产物经SDS检测， 在66 kDa 和43 kDa 处显示特异条带，分别与GST-His-Hep Ⅰ和His-Hep Ⅰ融合蛋白预期 分子量相符；最终His-Hep Ⅰ融合蛋白的比酶活为86.45 IU/mg，纯度高达99%，与仅一 步亲和纯化得到的GST-His-Hep Ⅰ融合蛋白相比，进一步提高了纯化后重组肝素酶的纯 度。纯化后Hep Ⅰ的酶学特性的初步研究结果表明：两种酶降解肝素的最适反应温度和 最适pH 均是30℃和pH 7.0 ，且两种酶的热稳定都比较差，但pH 稳定性均较好，在pH 7.0-10 的范围内4 ℃静置30 min 活性基本没有损失。此外4 种不同酶保护剂对酶活性的 影响结果表明：BSA(0.1%) ，TW 80(0.001 mmol/L) ，CaCl (1 mmol/L)和DTT(0.5 mmol/L) 2 对Hep Ⅰ分子结构的稳定和活性的保持均能产生积极的保护作用。重组Hep Ⅰ裂解肝素 所得产物的GPC-MASS 结果表明：GST-His-Hep Ⅰ和His-Hep Ⅰ融合蛋白均能很好的裂 解肝素，裂解产物的平均分子量均在7000 Da 左右，它们具有类似的催化活性和底物特 异性。 关键词：肝素酶Ⅰ；GST-His 双标签；优化；纯化；酶学性质 I Abstract