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PCR引物的优化设计 PCR引物设计的目的是为了找到一对合适的寡核昔酸片段，其中在扩增的DNA片断5’端的引物对应于有意链DNA序列，3’端的引物对应于无意链DNA序列，使其能有效地扩增模板DNA序列。因此，引物的优劣直接关系到PCR的特异性与成功与否。要设计引物首先要找到DNA序列的保守区。同时应预测将要扩增的片段单链是否形成二级结构。若这个区域单链能形成二级结构，就要避开它。如这一段不能形成二级结构，那就可以在这一区域设计引物。 根据实验需要，确定需要扩增的DNA序列，并知道其CDS区序列（编码结构基因区,即从起始密码子区至终止密码子区 1. 根据实验需要，确定需要扩增的DNA序列，并知道其CDS区序列（编码结构基因区,即从起始密码子区至终止密码子区） ncbi网站查询 2. 选择所需的载体,确定合适的酶切位点。 所选择的酶切位点尽量为多克隆位点的中间酶切位点，且载体上其它地方无该酶切位点。这样连接以后再构建新的质粒时选择酶的空间更大些。并保证所需扩增的DNA序列中无该酶切位点（generunr分析）。 4. 正向引物的设计 4.1酶切位点的位置选择。一般情况下都需要在引物的5’，3’端增加酶切位点，然后利用该酶将扩增产物切下，接到相应的载体上。 A：扩增的DNA用于表达时： (1) 自身有启动子。 如果要利用自身的启动子，扩增片段里应包含启动子，所以酶切位点应该在启动子前面。可在所扩增的DNA序列的启动子前寻找是否有该酶切位点，若有则直接利用该酶切位点进行扩增；若无可寻找与其基本相似的位点进行扩增。 (2) 扩增片段里自身无启动子。 对于自身无启动子而又用于表达的基因序列，必须将其接于外源启动子的后面才能顺利表达。在翻译过程中，mRNA必须首先与核糖体相结合才能进行蛋白质合成。在原核生物中，mRNA分子上有两个核糖体结合位点，一个是起始密码子 AUG，另外一个是起始密码子AUG上游3bp-11bp处的3bp-9bp的序列，后者由Shine J及Dalgarno L发现，故称为SD序列。SD序列富含嘌呤核苷酸，而16S rRNA3’端富含嘧啶核苷酸，二者刚好互补，可促进mRNA核糖体结合，提高翻译效率。因此，在基因重组过程中应将结构基因接于SD序列之后，以便为mRNA提供核糖体结合位点，提高基因表达效率。起始密码子与SD序列之间核苷酸数量变化过大会影响翻译效率，所以应该将目的基因的起始密码子与启动子的ATG相重叠，这样才能保证起始密码子与SD序列之间核苷酸数量不改变，不影响翻译效率。 一般的启动子3’断酶切位点是NcoI（CCATGG）或Nde I(CATATG)，若添加的酶切位点为NdeI，引物的5’端酶切位点设计为Nde I即可；若添加的酶切位点为NcoI时,应该根据目的基因起始密码子后的碱基种类的不同选择不同的酶切位点：如果该碱基是G，则可以直接设计为NcoI位点；如果该碱基不是G（如扩增的目的基因为5’-aagtcgtatg actaccgttc ccgatctcga-3’）因为NcoI位点ATG后的G与DNA起始密码子后的a不配对，所以在设计引物的酶切位点时不能象上例简单地设计为NcoI。在处理这个问题上有三种方法：一种是直接设计为NcoI位点,其缺点是改变了阅读框的第一个氨基酸，可能对表达会有影响；为了保证原始的阅读框，可采取以下两种方法：第二种方法是利用同尾酶连接法，即在保证起始密码子及其后的碱基不改变的情况下选择合适的酶切位点。如上例将引物的酶切位点设计为tcatga（BspHI的酶切位点）,这样既保证了阅读框的atga碱基，又因为BspHI与NcoI是同尾酶，所以可利用载体上的 NcoI位点与PCR扩增产物的BspHI位点进行连接；第三种方法是将酶切位点设计为末端三个碱基是目的基因起始密码子后的三个碱基的平末断限制性内切酶，然后将启动子的NcoI位点利用T4DNA Polymerase 补平，最后将二者连接，如上例可设计引物的酶切位点为agtact(ScaI位点)。 B：若扩增的DNA用于阻断. 因为只需要扩增出一定长度的与染色体DNA同源的序列，所以对酶切位点的位置无特殊要求。只需要寻找与所需扩增的DNA配对较好的区域作为酶切位点即可。 4.2克隆PCR产物的方法之一，是在PCR产物两端设计一定的限制酶切位点，经酶切克隆到用相同酶切的载体上。但实验证明，大多数限制酶对裸露的酶切位点不能切断。必须在酶切位点旁边加上一个至几个保护碱基，才能使所定的限制性酶对其识别位点进行有效切断。加的个数见Biolabs242所示，加的种类要和扩增的DNA序列相匹配。如NdeI,Biolabs显示在其酶切位点上加4个核苷酸时，酶切2小时，酶切效率达到50%，而加1个核苷酸时，酶切20