纳他霉素发酵生产实验报告.docVIP

纳他霉素的发酵生产、分离纯化及检测 （广州大学 生物工程系，广州510006 ） 摘要：本实验利用褐黄孢链霉菌斜面菌种，先取约5个接种环的斜面菌种无菌接种到2瓶种子液体培养基中培养24小时，再分别在无菌条件下用移液枪吸取1mL种子培养基转接到6瓶发酵培养基，摇瓶发酵48小时后，连续3天吸取菌液进行镜检，菌液OD值测定，并利用500μg/mL的纳他霉素按照0mL,0.2mL,0.4mL,0.6mL,0.8mL,1.0mL加入量制定标准曲线；摇瓶发酵5天后，合并发酵液，离心获得菌泥，采用2倍菌泥体积的95%酒精，pH值在10~10.5搅拌溶解纳他霉素；离心保留上清液，上清液在Ph值在6.5，冰箱静置3h，纳他霉素在等电点析出；离心，保留产物；产物在55℃真空干燥2h，称重获得0.08g的纳他霉素。 关键词：褐黄孢链霉菌；种子培养基；发酵培养基；等电点溶解；真空干燥 引言：纳他霉素是一种多烯烃大环内酯类抗真菌剂， 其分子是一种具有活性的环状四烯化合物，含3个以上的结晶水，其外观白色（或奶油色），为无色、无味的结晶粉末，分子式C33H47NO13，分子量为665.73。微溶于水、甲醇，溶于稀酸、冰醋酸及二甲苯甲酰胺，难溶于大部分有机溶剂。在pH值高于9或低于3时，其溶解度会有所提高纳他霉素具有一定的抗热处理能力，在干燥状态下相对稳定，能耐受短暂高温（100℃）；但由于它具有环状化学结构、对紫外线较为敏感，故不宜与阳光接触。纳他霉素活性的稳定性受PH值、温度、光照强度和氧化剂及重金属的影响，所以产品应该避免与氧化物及硫氢化合物等接触/view/727567.htm]。） 10 20 30 40 50 纳他霉素原液/mL添加量 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 水/ml 10 9.8 9.6 9.4 9.2 9 OD303 0 0.137 0.299 0.417 0.556 0.669 1.2.5纳他霉素的分离纯化： 合并全部发酵液，再12000r/min离心10min。离心前发酵液的体积与离心后上清液的体积之差即为湿菌泥的体积；加两倍湿菌泥体积的95%乙醇，20%氢氧化钠调pH10～10.5，边加边搅拌0.5h（注意一定要调过pH后再计时），以便纳他霉素充分溶解；然后再再12000r/min离心10min，保留上清液，将上清液用1mol/L盐酸调pH6.5，静置3h（冰箱），以便纳他霉素在等电点处沉淀析出；最后再12000r/min离心10min，保留沉淀（产物），将产物置于55℃真空干燥2h，称重。 2.实验结果与分析 2.1实验结果 2.1.1标准曲线制作结果： 因按表1中数据制作的标准曲线数值过大，故实验时，在6支工作溶液中各取1mL再加入4mL蒸馏水（此过程又稀释了5 倍）进行OD值测定，故标准曲线结果如下表2所示： 表2 纳他霉素标准曲线数据 管号 1 2 3 4 5 6 工作溶液浓度/(ug/mL) 0 10 20 30 40 50 纳他霉素原液/mL添加量 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 水/Ml 10 9.8 9.6 9.4 9.2 9 实际工作溶液浓度/(ug/mL) 0 2 4 6 8 10 OD303 0 0.137 0.299 0.417 0.556 0.669 以上表数据作出标准曲线，如图1所示： 2.1.2发酵液检测结果：（如表3所示） 表3 定时测量OD值数据表 培养时间/h 48 72 96 144 测得OD303 0.082 0.103 0.185 0.256 纳他霉素浓度（ug/mL） 1.080 1.392 2.608 3.662 2.1.3菌体镜检结果: (1)斜面菌镜检图片: 图1 ×40 斜面镜检图（孢子） 图2 ×100 斜面镜检图（菌丝） 图3 菌种斜面 (2)种子培养基中培养24h后菌体的镜检照片: 图5 ×40 种子菌检图 图6 ×100 种子菌镜检图 (3)发酵48h镜检结果: 图7 ×10 发酵48h镜检图 图8 ×40 发酵48h镜检图 图9 ×100 发酵48h镜检图（局部） 图9 ×40 发酵48h 镜检图（局部） (4)发酵72h镜检结果； 图10 ×10 发酵72h镜检图 图11 ×40 发酵72h镜检图 图12 ×40 发酵72 h镜检图（局部） (5)发酵96h镜检结果: 图13 ×40 发酵96h镜检图 图14 ×40发酵96h镜检图（局部）