基因工程-4-PCR和文库克隆法.pptVIP

（一）cDNA文库构建基本流程 RNA 的提取 合成 cDNA 第1链 cDNA 第2链的合成 将双链 DNA 克隆到载体中 分析 cDNA 插入片断 扩增 cDNA 文库 （一）、cDNA文库的建立 cDNA文库：指用一种生物的mRNA经逆转录合成的互补DNA所建立的文库。 1、mRNA分离 总RNA mRNA tRNA rRNA 2、合成cDNA第一条链 （1）随机引物引导法 （2）oligo（dT）引导法 （1）随机引物引导法 （2）oligo（dT）引导法 3′ 5 ′ mRNA AAAAAA T T T T T T 3′ 5 ′ AAAAAA T T T T T T Klenow酶 mRNA cDNA第一条链 3′ 5 ′ 5 ′ mRNA mRNA 3′ 5 ′ Klenow酶、连接酶、 3′ cDNA第一条链 dNTP dNTP 3、第二条链的合成 （1）自身引导法 （2）双链cDNA的置换合成 （3）引物-衔接头法双链DNA的合成 Clontech 1.基因文库的构建规模 （取决于基因组大小和插入片段的大小） 基因组文库的大小的估算： N=ln（1–P）/ln（1 – f） N：为基因组文库必需的克隆数目。 P：为文库中含目的基因DNA片段的出现概率，一般为99%。 f：是插入片段的大小与全基因组大小的比值。 二、基因组文库的构建