第五单元 基于PCR技术测定水处理厂进出水样中肠道病毒.docxVIP

基于PCR技术定量的实时测定意大利污水 处理厂流入和流出样中肠道病毒 Giuseppina La Rosa, Manoochehr Pourshaban, Marcello Iaconelli and Michele Muscillo 总结：肠道病毒广泛存在于污水中，研究消除污水中这种病毒的处理效果和他们释放到环境中或通过回收的废水带来的潜在的健康风险，都是环境微生物学中非常重要的课题。利用PCR（聚合酶链式反应）技术对罗马周边5个污水处理厂流入和流出水样中肠道病毒进行实时定量测定，发现三种流行病学的重要水性肠病毒：腺病毒、肠道病毒和诺沃克病毒（GⅠ和 GⅡ），并且和排泄物污染中的古菌指标进行了比较。其中，腺病毒在处理前后的废水中浓度是最高的，进水中的平均浓度大小为：腺病毒＞诺沃克病毒GⅠ＞诺沃克病毒GⅡ＞肠道病毒，出水中的平均浓度大小为：腺病毒＞肠道病毒GⅠ＞肠道病毒＞诺沃克病毒GⅡ。去除率分别为：肠道病毒35%，诺沃克病毒GⅠ78%，细菌99%。由于分子量化不能有效的表明它们对人体健康的实际威胁，因此通过完全细胞培养和PCR技术对已处理的出水中的肠病毒微粒的传染性进行评估。由传染性试验发现经过处理的水中活的细菌体通过排放进入环境会对公共健康带来潜在的威胁。由此对病毒的存在和抗污水净化流程对有效的管理回收处理的废水有关的风险的潜在影响，以及它们进入环境的影响有一个更好的了解。 关键词：诺沃克病毒，腺病毒，肠道病毒，污水，实时定量PCR试验 引言 肠病毒主要是通过粪便排出，而当前的污水处理通常不能有效地去除这些生物体。大量的经处理和未处理的污水排入水体中，会对农业、娱乐以及饮用水有潜在的影响。当前，诸如粪大肠杆菌和肠球菌等细菌指标经常用于水质评价。这些细菌很常见，并且测量费用便宜，但是作为粪便污染的指标不是很理想。实际上，用当前的污水处理方法去除致病性肠道病毒比去除肠原杆菌更难。不同的研究发现，不论哪种处理方法肠道病毒在污水中都保持一个较高的数量，由此提出用一种病毒指示器反应废水污染。肠道病毒（EVs）和腺病毒（ADVs）就被建议用来作为监测水中人类粪便污染和确定消毒效果的指示。对污水处理站的监测，为研究病毒在各自的生活区域中的循环和这些病毒在已处理出水中存留率提供了一个合适的途径。 目前研究的目标是评价废水处理前后三种流行病学的重要水性肠病毒：腺病毒、肠道病毒和诺沃克病毒（诺沃克病毒GⅠ和诺沃克病毒GⅡ）的浓度，得到对已处理污水的病毒污染的潜在传染性的观察，并获得消毒效果的初略估计。作为对比，也对作为粪便污染指示的大肠杆菌和肠球菌两种肠原杆菌进行测量和量化。 肠道病毒只有单链RNA，是非包膜病毒。肠道病毒感染的症状包括轻度上呼吸道疾病、发热性皮疹、无菌性脑膜炎、胸膜痛、脑炎、急性弛缓性麻、麻痹脊髓灰质炎、肠胃炎、心肌炎、心包炎和糖尿病。 腺病毒有双链DNA，是非包膜病毒，有52个血清型，分成A、B、C、D、E、F六个亚种。感染症状包括肠胃炎、咽炎、肺炎、结膜炎,脑膜脑炎 诺沃克病毒是鉴定急性非细菌性肠胃炎最常见的病毒，它有一单链RNA，这些病毒属于环状病毒科，分为GⅠ—GⅤ五个群。 各组病毒通过适当的实时定量PCR（或RT-PCR）实现量化。实时定量PCR在水环境中是核酸量化的一种重要工具，该法灵敏，且有特异性，与其他方法相比更快，更简单。 定量分子试验不能区分活的和灭活的病毒颗粒，因此大量病毒颗粒存在并不能表明对人体健康的现实影响。因此，评估已处理废水中肠道病毒感染性，可通过综合培养和实时定量PCR（ICC-RT–PRC），这是一种将灵敏的传统定量PCR与一个传染性试验相结合的方法。 方法 样品采集 选择意大利中部的五个不同城市的污水处理厂，每个厂之间相距30km。这几个所选的污水处理厂都是用传统的活性污泥法处理城市污水。废水在排入水体前，处理过程主要包括格栅分离，初级沉淀，二级生物处理和最终的氯消毒。每天进入这些工厂的废水量从4800到750000m3不等，设计处理能力从60000到1100000人口当量，并且这些厂不处理工业废水。 总共采集50个样品（25个进水，25个出水，每个样品50mL）。从2007年5月到9月，每月采样一次。每次采样时间为一个星期天早上，用50mL无菌的离心管储存置于4℃恒温袋中，在24小时内送回实验室。 病毒浓缩和RNA提取 病毒的浓缩如前所述，简单地说，4℃下以3000×g样品离心分离10min，再取上清液以200000×g离心分离2h。在悬浮液中加入1mL磷酸盐缓冲液使悬浮颗粒溶解，在-80℃下保存到提取出基因组。 为评估病毒复活率，在50mL蒸馏水中加入1.91×108个艾柯病毒2（康纳利斯菌株，美式培养，ATCC，VR-32）的基因组拷贝（GC），计算用实时定量PCR浓缩后与浓缩前基因