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第 22 卷 　第 4 期 物 　理 　学 　进 　展 Vol . 22 ,No . 4 　2002 年 12 月 PRO GR ESS IN PH YSICS Dec . ,2002 文章编号 (2002) 全 内 反 射 荧 光 显 微 术 王琛 ,王桂英 ,徐至展 ( 中国科学院上海光学精密仪器研究所强光光学开放实验室,上海　201800) 摘 　要 : 　全内反射荧光显微技术是当今世界上最具前途的新型生物光学显微技术之一 , 可以用来实现对单个荧光分子的直接探测。它利用全内反射产生的隐失波照明样品 ,使照明 区域限定在样品表面的一薄层范围内 ,因此具有其它光学成像技术无法比拟的高的信噪比和 对比度。近年来 , 已被生物物理学家们广泛应用于单分子的荧光成像中。本文系统的介绍了 全内反射荧光显微技术的原理、国内外的发展和现状及其在生物学上的应用 ,并对其未来做 了展望。 关键词 : 　单分子探测 ;荧光分子 ;全内反射荧光显微术 ;隐失波 中图分类号: 　TH742. 65 　　　　　　　　　　文献标识码 : 　A 0 　引　言 1590 年 ,Z.Janssen 和 H.Janseen 共同研制出世界上第一台光学显微镜。在随后的几 百年间 ,显微科学取得了迅猛的发展。人们逐渐地改进了成像质量 ,而且各种新的光学显 微镜也应运而生 ,如偏振光显微镜、相差显微镜、倒置显微镜。但是传统的光学显微镜由 0. 61 λ 于受到光瞳远场衍射效应的影响 ,存在分辨极限 ,瑞利将之归纳为 R ≥n sin θ,其中 λ为 θ 成像光波波长 , n sin 为物透镜的数值孔径 , 即 N A 值 。因此 ,对可见光来说 ,光学显微镜 空间分辨极限～250 nm 。从应用的角度 ,传统的光学显微术无法满足更高的分辨率要求 。 生命科学中大量的事实表明细胞的动力学特征是起源于单个蛋白质分子的聚合和相 互作用 ,这就要求发展超高分辨率的成像技术 ,从而在分子尺度上探测细胞生命活动的细 节 。在这种需求下 ,20 世纪 30 年代电子显微镜发展起来 。它导致了细胞研究的革命 ,使 得生物学家得以从亚显微水平上认识细胞世界 。进入 80 年代 ,非光学类扫描探针显微术 特别是原子力显微镜的出现更是将成像的分辨率推进到纳米的精度 。但是这些显微术均 收稿日期 : ( ) ( ) 基金项目 : 上海市科学技术发展基金 01DJ GK018 , 国家自然科学基金 No. 以及国家科技部 ( ) 重大基础研究基金的资助 G1999075200 　4 期 王琛等 :全内反射荧光显微术 407 在不同程度上存在系统结构复杂 、成像检测环境要求苛刻等困难 ,尤其是不能象光学显微 ( ) 术那样提供重要的光学信息 如偏振态 、折射率 、光谱等 和进行无损伤性生物活体探测 , 这些均严格限制了它们在高分辨率细胞成像中的应用 。 与此同时 ,新一代光学显微技术发展起来 。它们以其高的空间分辨率和时间分辨率 、 无损伤 、以及对单分子活体探测的可行性 ,再次成为生物学家 、物理学家和成像学家们研 究的热点 。目前国际上公认的最有前途的单分子光学成像技术有全场相衬显微术 、共焦 荧光显微术 ,近场光学扫描显微术和全内反射荧光显微术[ 1 ,2 ] 。这些技术在分子生物学 、 分子化学 、激光医学及纳米材料等领域受到广泛关注