家蚕PGRP-S5基因的重组表达和功能分析.pdfVIP

资助项目 国家重大基础研究发展计划（973 计划）子课题（2012CB114604 ）；教育部基本 科研业务费专项资金（CX200908 ）。 家蚕 PGRP-S5 基因的重组表达和功能分析 摘 要 无脊椎动物天然免疫（Innate immunity ）系统的启动由体内的模式识别受体（Pattern Recognition Receptors ， PRRs ）对外源入侵病原物表面相关分子模式(Pathogen Associated Molecular Patterns, PAMPs) 的识别引起。在昆虫和其他节肢动物中，肽聚糖识别蛋白 （Peptidoglycan Recognition Proteins ，PGRPs ）作为一类PRR ，可以结合并识别细菌表 面的肽聚糖（Peptidoglycan ，PG ），在激活免疫调控途径中有着重要作用。果蝇（Drosophila melanogaster ）中有关PGRPs 在免疫过程中的研究较多，家蚕（Bombyx mori ）的PGRP 家族中有 12 个不同的 PGRP 基因，然而大部分功能至今还并不清楚。本实验以家蚕为 研究对象，克隆了 PGRP-S5 基因，并对其在家蚕免疫中的功能进行了研究。 1. 实验中给家蚕注射及喂食革兰氏阴性菌绿脓杆菌（Pseudomonas aeruginosa ， P. aeruginosa ）或革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus, S. aureus ）后，在 不同时间点，运用半定量 RT-PCR 检测方法,发现脂肪体和中肠中的 PGRP-S5 基因转录 水平明显上调，血细胞中变化较微弱。说明 PGRP-S5 在家蚕中受到细菌感染的调控。 2.生物信息学分析显示，家蚕的 PGRP-S5 全长基因与棉铃虫、蓖麻蚕、烟草天蛾、 果蝇、蜡螟、冈比亚按蚊及赤拟谷盗等昆虫中已发现的 PGRPs 的氨基酸序列及T7 溶菌 酶的氨基酸序列具有较高的相似性。序列比对结果显示，果蝇 PGRP-LB 的五个结合锌 离子的酰胺酶活性位点，在家蚕 PGRP-S5 中都具有。 3. 对家蚕 PGRP-S5 的活性结构域进行克隆，该段cDNA 全长为 387bp，编码 135 个氨基酸。在线软件预测该蛋白等电点为 5.99，理论分子量约为 17kD。扩增出家蚕 PGRP-S5 基因活性结构域的编码序列，连接到原核表达载体 pSMF 再转化入大肠杆菌进 行重组表达。表达的重组蛋白再经过 SUMO 酶酶切，可将实验所需目的蛋白 PGRP-S5 从融合蛋白切下。两次蛋白纯化均通过 Ni-NTA 亲和柱完成。 4. 利用得到的重组 PGRP-S5 活性域蛋白分别与 Lys 型和 DAP 型肽聚糖 （Peptidoglycans, PG ）进行结合实验，发现其对革兰氏阳性菌的DAP 型 PG 具有较强的 结合能力，而对革兰氏阳性菌的 Lys 型 PG 结合较弱或无结