植物（豆芽）吡哆胺—吡哆醛转换反应作用酶的分离纯化及表征.pdfVIP

摘要 维生素 B (VB )是一类吡啶化合物的总称，游离型为吡哆醇(Pyridoxine, PN)、吡 6 6 哆胺(Pyridoxine, PM)和吡哆醛(Pyridoxal, PL)，三者相应磷酸酯形式为磷酸吡哆醇 (Pyridoxine-5’-phosphate, PNP)、磷酸吡哆胺(Pyridoxine-5’-phosphate, PMP)和磷酸吡哆 (Pyridoxal-5’-phosphate, PLP) PLP VB 醛 。其中 是 6的主要辅酶形式，参加催化涉及氨 基酸的各种代谢反应，在其他多种物质的合成和代谢过程中也发挥着重要作用。 PM-丙酮酸转氨酶(Pyridoxamine-Pyruvate aminotransferase, PPAT)催化 PM 和 PL PM PL L- 之间的相互转化，它以 和丙酮酸为底物生成 和 丙氨酸，同时谷草转氨酶 (glutamic-oxaloacetic transaminase,GOT)在脱掉 PLP 辅基的条件下也可以催化 PM 和 PL的相互转化，这些分别在微生物和动物中被发现证实，植物体内也存在 PM和 PL 的相互转化，但作用酶及其酶的性质还不明确。 本论文首先对豆芽中的 GOT进行分离纯化，粗酶液经过两次硫酸铵分段沉淀、 两次 Sephadex G-100 凝胶过滤柱层析、两次 DEAE-Sepharose Fast Flow 阴离子交换 柱层析等分离纯化技术，GOT被纯化了 200.8倍，通过对纯化酶的底物特异性分析， 发现 GOT全酶并不能催化 PM 和丙酮酸反应生成 PL和丙氨酸，只有在脱 PLP 辅基 (pH2.7)的条件下，才能催化 PM和草酰乙酸反应生成 PL。 对豆芽中的 GOT 进行纯化分析后，再对豆芽中的 PPAT进行分离纯化，通过两 次硫酸铵分段沉淀、两次 Sephadex G-100凝胶过滤柱层析、两次 DEAE-SepharoseFast Flow 阴离子交换柱层析等分离纯化技术，对新鲜豆芽中的吡哆胺-丙酮酸转氨酶进行 分离纯化，经 SDS电泳检测，样品呈现单一条带。研究结果表明：该酶被纯 化了 207.56倍，得率为 7.84%；通过底物特意性分析发现：以 PM和丙酮酸为底物时， PPAT表现出最大活性，可见此酶具有很强的专一性；PLP 既不能促进也不能抑制其 反应的进行；因转氨酶的转氨反应机制都属于乒乓反应机制，因此采用乒乓反应机制 对两步转氨反应进行研究，所以在最适反应条件下，以吡哆胺和丙酮酸为反应底物时 测得酶的 Km值分别为：1.7765mmol/L和 5.3335mmol/L。这对进一步研究植物体内 VB6代谢机制奠定了基础。 关键词：豆芽；吡哆胺-丙酮酸转氨酶；谷草转氨酶；分离纯化；酶学性质 I Abstract VitaminB isthegeneraltermforakindofchemical compounds,includingthefree 6 formsofPyridoxine(PN),Pyridoxamine(PM),Pyridoxal(PL) andthephosphateformsof Pyridoxine-5’-phosphate(PNP),Pyridoxamine-5’-phosphate(PMP),Pyridoxal-5’ -phosph- ate(PLP).Pyridoxal-5’-phosphateacts astheessentialcoenzyme inmanymetabolictransi -tionofaminoacidsandplays animportantroleinavarietyofsyntheticandmetabolicrea -ctions. PPAT can catalyze conversion between PM and PL, it with PM and pyruvate as the substrate generated PL and L - alanine w