免疫细胞分离技术(终).ppt

亲和板结合分离法（阳性选择法） （1）将相应抗体结合于塑料平板上 （2）加细胞悬液 （3）各种淋巴细胞亚群具有不同抗原性的特点和表面标志，抗原阳性的细胞与相应的固相抗体结合，吸附在平板上 （3）多次细胞洗涤后我们将得到吸附在平板上的抗原阳性细胞 （4）同理若用特异性抗原交联于塑料板上，则可分离得到具有特异抗原受体的淋巴细胞。但淋巴细胞受体与特异抗原或抗体连接后有可能引起细胞激活，因此，凡欲去除细胞悬液内某一细胞亚群时，即将其用于阴性选择，本法更合适。 * 免疫磁珠法分离细胞原理： ??? 免疫磁珠法分离细胞是基于细胞表面抗原能与连接有磁珠的特异性单抗相结合，在外加磁场中，通过抗体与磁珠相连的细胞被吸附而滞留在磁场中，无该种表面抗原的细胞由于不能与连接着磁珠的特异性单抗结合而没有磁性，不在磁场中停留，从而使细胞得以分离。 免疫磁珠法分为阳性分离法和阴性分离法：??? 阳性分离法－磁珠结合的细胞就是所要分离获得的细胞??? 阴性分离法－磁珠结合不需要的细胞，游离于磁场的细胞为所需细胞。 荧光激活细胞分离仪(FACS)分离法 主要原理是细胞经荧光染色后，通过高速流动系统，细胞排成单行，逐个流经检测区进行测定。当细胞从流动室喷嘴处流出时，超声振荡搅动液流，使液流断裂成一连串的均匀小滴（40000个/s），每小滴内最多含一个细胞（其中只有百分之几的液滴中含细胞），细胞经激光束照射产生荧光和散射光，由光电倍增管接收，转换成脉冲信号，数据经电脑处理，分辨细胞的类型。如识别的是预计所需的细胞时（如T细胞、B细胞要其亚群），在细胞样品流断裂成小滴时，使液滴瞬即感应阳电荷、阴电荷或不带电荷，使所需的细胞在电场偏转下进入不同的收集管; 优点：用FACS分离细胞准确快速，能保持细胞活力，并可在无菌条件下进行； 局限：仪器昂贵，极少用于常规，而多数仅作为研究的手段 * * 荧光激活细胞分离仪 整体分离结果 至此，通过细胞分离技术，淋巴细胞分离三步走已完成 欲获取小鼠、大鼠、豚鼠等小动物的巨噬细胞，可经腹腔内注入少许石蜡油，3～4天后冲洗出腹腔渗出液，所得细胞悬液中70％～80％为巨噬细胞。 * 免疫细胞分离技术（针对淋巴细胞） 向珍娟 龚琦青 周武 免疫细胞分离技术的意义 我们知道进行有关细胞免疫方面的检测，特别是有关免疫细胞功能的体外实验，往往须将待检淋巴细胞从血液或组织中分离出来，而外周血会有多种细胞成分，包括淋巴细胞、单核细胞、粒细胞、红细胞和血咆群体。但有些细胞如淋巴细胞的物理特性及生化特性与其他细胞差异甚微，用简单的方法不容易分纯，因此产生了专门的细胞分离纯化技术。 白细胞分离 吞噬细胞的分离和收集 淋巴细胞分离  白细胞的分离 自然沉降法 聚合物加速沉降法 自然沉降法 采集血液 试管直立静置室温（30~60min） 抗凝（如加肝素） 血浆层 白细胞层 红细胞层 吸管吸取白细胞层 置新试管中 离心 弃上清并洗涤 加蒸馏水 低渗处理（裂解红细胞） 反复洗涤 得纯度较高的白细胞悬液 聚合物加速沉降法 本法是利用高分子量的聚合物如明胶、右旋糖酐、聚乙烯吡喀烷酮（PVP）等使红细胞凝集成串，加速红细胞沉降，使之与白细胞分离。 优点：本法的细胞获得率比自然沉降法高。 吞噬细胞的分离和收集 方法：斑蝥敷贴法 操作：用滤纸蘸取10％中药斑蝥酒精浸出液，贴敷在臂内侧皮肤表面，4～5h后皮肤局部充血，48h后局部形成水疱，吸取疱中的组织液，内含巨噬细胞； 优点：可从人体组织液中获取较纯的巨噬细胞，不需作进一步体外分离，细胞量损失较少； 缺点：此法对病人皮肤有一定损伤，有时可引起局部感染，应慎用。 * 淋巴细胞分离三步走 （一）外周血单个核细胞的分离 （二）纯淋巴细胞群的采集 （三）淋巴细胞亚群的分离 （一）外周血单个核细胞的分离 外周血中单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞，其体积、形态和密度与其他细胞不同，红细胞和多核白细胞密度较大，为1.090左右，而淋巴细胞和单核细胞密度为1.075～1.090，血小板为1.030～1.035。为此利用一种密度介于1.075～1.092之间而近于等渗的溶液（分层液）做密度梯度离心，使一定密度的细胞按相应密度梯度分布，从而将各种血细胞加以分离。 Ficoll 分层液法 外周血单个核细胞的分离 Ficoll 分层液法 Percoll 分层液法 分层液 基本要求 ①对细胞无毒 ②基本等渗 ③不同于血浆等分离物质 ④有一定的比重 最佳选择（目前） Ficoll（聚蔗糖-泛影葡胺溶液）： 2份6％聚蔗糖蒸馏水溶液+1份34%泛影葡胺生理盐水溶液组成，其比重为1.