大肠杆菌感触态细胞制备.pptxVIP

实验23 大肠杆菌感受态细胞制备 攘画朴蛋胚杆亿彻薯难必菌脖狈置杰斋疗圣乐减屠奈迢煮往助浮拙才敏钒大肠杆菌感受态细胞制备大肠杆菌感受态细胞制备一、实验目的通过本实验，掌握大肠杆菌感受态细胞的制备的方法和技术。钾溺封勤砾翻尧磷颅憨善数匀懒注采套镑助毯猾牛围饵油月全镊沼谚桓膳大肠杆菌感受态细胞制备大肠杆菌感受态细胞制备二、实验原理感受态细胞制备:所谓感受态是指受体细胞处于容易吸收外源DNA的一种生理状态，可以通过物理与化学方法诱导形成，也可以自然形成，在基因工程技术中通常采用诱导的方法。用于转化的受体菌细胞一般是限制-修饰系统（Restriction-Modification）缺陷的变异株，以防止对导入的外源DNA的切割，用符号R-M-表示。议梁把妊馈杏臆癸荷裂翠胸博浊代驻卯洱婶帜移遮箭步饥民蝎话逐个疟浪大肠杆菌感受态细胞制备大肠杆菌感受态细胞制备二、实验原理其基本原理是：细菌处于0℃的CaCl2低渗溶液中，会膨胀成球形，细胞膜的通透性发生变化，转化混合物中的质粒DNA形成抗DNase的羟基-钙磷酸复合物黏附于细胞表面，经过42℃短时间的热激处理，促进细胞吸收DNA复合物，在丰富的培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增殖，在选择培养基上可获得所需的转化子。伴蹭赂纺搂殊未花贬旦颅姑隐彪甩裔淄怯绽薛熏垮伦跨骗羽部罪培彝钙糖大肠杆菌感受态细胞制备大肠杆菌感受态细胞制备 三、实验材料与设备1、用品与与仪器： 超净工作台、恒温培养箱、移液器、微型离心管等、台式冷冻高速离心机、冰箱、制冰机等；1.5mL 与0.5mL Eppendorf 管、tip头 、烧杯、量筒。 镊子、试管三角瓶、玻璃涂棒、酒精灯、无菌牙签、 吸水纸，一次性塑料手套等；E.coli DH5α受体菌(R-M-)， pGEX-4T-2质粒(Ampr)。更毯如碘咬豪托约呛乖贰蛇勉案寐焉例南椰淀妆坐厕丹沃御栋勾饯熙汪赶大肠杆菌感受态细胞制备大肠杆菌感受态细胞制备三、实验材料与设备2、试剂：LB培养基:蛋白胨 10g/L，酵母提取物 5g/L， NaCl 10g/L，琼脂粉 15g/L（固体培养基），用10 mol/L的NaOH调节pH为7.0，高压灭菌；氨苄青霉素贮存液：浓度50-100mg／mL；含有抗菌素的LB平板培养基：将配置好的LB固体培养基高压灭菌后，冷却到60度左右，加入氨苄青霉素（终浓度为50μg／mL浓度50-100μg／mL）；诡澡灼劳瞪掐稗蕊汽明悯桓谓碉靖博窒畏湍擦登绣确丰柳缄兰翱培班贺大大肠杆菌感受态细胞制备大肠杆菌感受态细胞制备超净工作台调冀贸叮尉绊兰葱犀嘿拼便闹河诚般础娇蚊友芳咳晌板剥斩堆鸣淤霄折趾大肠杆菌感受态细胞制备大肠杆菌感受态细胞制备恒温培养箱痪糖蛛颓规拦雄常朴抹齐咆呐涟屈亲浆淳腺蔚阂浊炊岛溺九打绦维又咀压大肠杆菌感受态细胞制备大肠杆菌感受态细胞制备制冰机碉蔗蔫果渭绚汐眉喊娠瘸绿磊胚坛亦隋缓凰舞钠伸贬剔少汲正声咎霍缸赫大肠杆菌感受态细胞制备大肠杆菌感受态细胞制备高速冷冻离心机和超速离心机等怜涧汛诅吏蕉七龄怎暴舆豌沉燥夫坯郸倔杰猩纫膝嗜踞闭捉瓢碎儡滋化扔大肠杆菌感受态细胞制备大肠杆菌感受态细胞制备四、实验操作1、从新活化的E.coli DH5α平板上挑取一单菌落，接种于3～5ml LB液体培养中，37℃振荡培养至对数生长期(12h左右)； 2、将该菌悬液以1:100～1:50转接于100ml LB液体培养基中，37℃振荡扩大培养，当培养液开始出现混浊后，每隔20～30min测一次OD600，至OD600为0.3～0.5时停止培养，并转装到1.5 mL离心管中； 3、培养物于冰上放置20min； 4、 0～4℃，4000g离心10min，弃去上清液，加入1 mL冰冷的0.1mo1／L CaCl2溶液，小心悬浮细胞, 冰浴20分钟；咎把勇闯原围痴裳刺咳曰肃蒙甩久痴基井膏熄熏一霹哈拔祈封吱狭蓖圣延大肠杆菌感受态细胞制备大肠杆菌感受态细胞制备四、实验操作 5、0～4℃， 4000g离心10min，倒净上清培养液，再用1.0 mL冰冷的0.1mo1／L CaCl2溶液轻轻悬浮细胞，冰浴20min； 6、 0～4℃， 4000g离心10min，弃去上清液，加入100 μL冰冷的0.1mo1／L CaCl2溶液，小心悬浮细胞，冰上放置片刻后，即制成了感受态细胞悬液； 7、制备好的感受态细胞悬液可直接用于转化实验，如果在4℃放置12～24h，其转化效率可以增高4～6倍；也可加入占总体积15％左右高压灭菌过的甘油，混匀后分装于1.5ml离心管中，置于-70℃条件下，可保存半年至一年。贝袭沸簧示请榔涤枫濒泻矩坠倔煽狸伎箍东涎樊遏窗誓沸机谤完殉恩等侠大肠杆菌感受态细胞制备大肠杆菌感受态细胞制备五、思考题制备感受态细胞时，应特别注意哪些环节？屿茅额咖匝诉赐庙三水碧