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产气荚膜梭菌β1毒素基因克隆与表达 　　摘要：以C型产气荚膜梭菌中PCR扩增出β1毒素基因，构建了表达质粒pGEXKG-β1，将构建的KG-β1转化受体菌BL21（DE3），得到重组菌株BL21/KG-β1。对重组菌株诱导的表达产物进行了SDS分析，结果表明重组菌株可以高效表达毒素蛋白。 　　关键词：产气荚膜梭菌；β1毒素；克隆表达 　　中图分类号：Q78 文献标识码：A 文章编号：1007-273X（2016）09-0007-02 　　产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens）在自然界中广泛分布，是人和动物肠道内的一种正常菌，能产生a、β、ε、ι四种主要毒素，根据产生这四种毒素种类的不同，可将产气荚膜梭菌分为A、B、C、D、E五种类型[1]。该菌在家禽中主要是能引起坏死性肠炎，鸡源产气荚膜梭菌主要是A型，但也有C型，C型产气荚膜梭菌主要产生a和β两种毒素。其中β毒素具有细胞毒性和致死性的特点，是重要的致病因子[2]。课题组在前期进行了鸡源产气荚膜梭菌a毒素的克隆表达及免疫原性研究[3]，本研究旨在进一步对β毒素进行克隆表达，为其诊断试剂和亚单位疫苗的研究提供基础。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 　　1.1.1 菌株与载体 C型产气荚膜梭菌、受体菌大肠杆菌DH5a和BL21（DE3）和pGEX-KG载体由湖北省农业科学院畜牧兽医研究所保存。 　　1.1.2 主要试剂 限制性核酸内切酶BamH I和Xho I、PCR试剂盒均购自宝生物工程（大连）有限公司；RNaseA、Taq DNA聚合酶均购自宝生物工程（大连）有限公司；细菌DNA提取试剂盒购自OMEGA公司。 　　1.2 方法 　　1.2.1 引物合成 参照NCBI中产气荚膜梭菌β1毒素全基因组序列，设计1对β1毒素基因引物，上游引物CPb01： 5′-ACGGGATCCTTAGTTATAGTTAGTTCACTTT-3′，下游引物CPb02：5′-ACGCTCGAGCTAAATAGCTGTTACTTTATG-3′，目的片段大小为1 008 bp，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。上游引物和下游引物分别含有BamH I和Xho I酶切位点。 　　1.2.2 全基因组的提取 将产气荚膜梭菌在厌气肉肝汤中于37 ℃厌氧培养过夜离心后，将沉淀菌细胞重悬于含2 mg/mL溶菌酶的TE溶液中，混匀后30 ℃水浴10 min。按照OMEGE bacterial DNA Kit说明书进行全基因组的提取。 　　1.2.3 PCR扩增 50 μL PCR反应体系为：10×Buffer缓冲液5.0 μL，MgCL2（25 mmol/L）4.0 μL，dNTPs（10 mmol/L）1.0 μL，模板5 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各2 μL和Taq DNA聚合酶（25 U）1.0 μL，加灭菌双蒸水补足至50 μL。PCR反应条件：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35个循环；72 ℃延伸10 min。取5.0 μL PCR产物于1.0%琼脂糖凝胶电泳，观察结果。 　　1.2.4 PCR产物的回收、连接转化及鉴定 PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳回收后，以DNA胶回收试剂盒回收PCR产物，按说明书操作。将回收纯化的目的产物与pGEX-KG载体双酶切后，转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞，以含有氨苄西林（Amp）抗性平板进行筛选培养，挑取白色菌落于含Ampr的LB液体培养基上培养过夜，以SDS碱裂解法提取重组质粒，经PCR鉴定及BamH I和Xho I双酶切分析筛选阳性克隆。 　　1.2.5 阳性质粒的诱导表达及表达产物的SDS分析 将构建的阳性质粒转入受体菌BL21（DE3）经37 ℃加IPTG诱导后，按文献[4]报道的方法收集菌体变性处理后，进行SDS电泳分析。 　　2 结果与分析 　　2.1 PCR鉴定结果 　　采用设计的特异性引物进行β1毒素基因的PCR扩增，经1%琼脂糖凝胶电泳，结果表明，以产气荚膜梭菌为模板扩增出约1 000 bp的特异性条带，与预期大小相符（图1）。 　　2.2 重组质粒的双酶切鉴定 　　将质粒经PCR鉴定后用限制性内切酶BamH I和Xho I进行酶切鉴定，结果见图2。由图2可见，经双酶切后可获得大小约为5 000和1 000 bp的2条DNA条带，即pGEX-KG载体和目的基因条带，初步表明成功构建产气荚膜梭菌β1毒素克隆表达质粒。 　　2.3 β1毒素基因表达产物SDS分析 　　将BL21（DE3）菌株作为表达的宿主菌，经转化挑取单个菌落培养诱导后，菌体经超声波处理，提取包涵体，上清经80%饱和硫酸铵沉淀后得到浓缩，沉淀