生化实验—蛋白质含量测定.docx

实验一：蛋白质含量测定方法的研究---非蛋白物质的可能干扰及其干扰程度的研究分析摘要：本次实验通过分别利用三种方法（Folin-酚法，考马斯亮蓝（G-250），紫外法）平行测定纯蛋白溶液和生物材料中蛋白的含量，分别计算和比较每种材料通过三种方法测定结果的差异性。再利用同时进行的11组实验的数据进行整合分析。最后通过比较两种待测液在三种方法测定下的差异性来分析非蛋白质干扰因素对三种方法的影响及影响程度。关键字：比色法，蛋白质含量测定，非蛋白质干扰因素，差异比较与分析研究背景及目的实验室测定蛋白质含量的方法多种，且依照不同的应用方向，依照不同的原理有多种蛋白质含量的测定方式。目前蛋白质含量测定的主要应用方法是比色法，但是由于实验操作以及设备存在误差，所以蛋白质溶液的真实浓度难以知晓，因此不能直接恒量各种方法在不同测定环境中的差异性。同时在实际的测量中，由于生物样品的复杂性，目标溶液中往往存在着诸多非蛋白干扰因素。因此需要实验者通过多种方法，有一定的数据支持，从可依靠的数据的线性变化中寻求合理的数理参照，从而对非蛋白干扰因素的影响程度做以分析和比较。原理本次实验选取三种实验方法——Folin-酚法，考马斯亮蓝（G-250）法和紫外法：Folin-酚法的原理利用是蛋白质中含有酚基的氨基酸数与蛋白质浓度呈正比，从而对特殊残基的测定来确定蛋白质含量；考马斯亮蓝法的原理是在一定蛋白质浓度范围内，蛋白质与色素结合物在595nm波长下光的吸收与浓度呈正比，故可用于蛋白质的测定；紫外法的原理是：蛋白质在紫外光下，吸收高峰在280nm左右，在此波长范围内蛋白质溶液的光密度值与浓度呈正比。本次实验测定的对象为纯蛋白溶液（BSA，牛血清白蛋白）和生物材料（绿豆芽下胚轴蛋白的提取液），分别作为无非蛋白质干扰和非蛋白质干扰的两个实验组。通过分别对两种溶液利用三种方法进行测定。用数理处理和分析来衡量三种方法在测定中的波动，比较两待测液即纯蛋白和生物组织提取液之间的波动情况的差异。通过两组数据的标准差之间的差异，来分析非蛋白干扰因素对不同实验方法测定的影响是否存在以及影响程度的大小。仪器试剂3.1仪器722-光栅分光光度计（上海精密科学有限公司分析仪器厂），JP-100架盘药物天平（北京天平物华医疗仪器有限责任公司），UV9600紫外分光光度计（北京瑞利分析仪器公司）。3.2试剂1mg/ml BSA（牛血清蛋白）标准溶液，Folin-酚法试剂甲，Folin-酚法试剂乙，考马斯亮蓝G-250溶液。3.3材料待测液一：未知浓度牛血清蛋白；新鲜豆芽下胚轴。3.4其他设备50ml 烧杯三个；50ml容量瓶一个；移液枪四只（200ul,1000ul*2,5000ul，大龙牌）；具塞试管44只；研钵、玻璃漏斗、玻璃棒、滴管各一个。实验步骤4.1标准曲线母液的配置使用移液枪将1mg/ml BSA原液分别在刻度的具塞试管配置250μg/ml BSA标准液15ml，100μg/ml BSA标准液15ml。作为标准曲线绘制中使用的母液，备用。4.2生物样品待测液二的配置用托盘天平称取1.5g绿豆芽下胚轴（掐头去尾），再用研钵研磨至匀浆状态，少量多次用蒸馏水转至50ml容量瓶，并且直接定容，颠倒浸提5分钟后，用漏斗过滤，所得滤液即为待测液2。4.3 Folin-酚法标准曲线绘制及待测液测量按照下表标记试管，分别加入试剂及材料，并用722-光栅分光光度计在650nm下用测定吸光度建立标准曲线。管/mlBSA原液(ml)00.20.40.60.81.0待测液1各0.2ml待测液2各1ml蒸馏水 (ml)1.00.80.60.40.20各0.8试剂甲各5ml，混匀，RT（室温）10min试剂乙各0.5ml，立即 混匀，RT：30min ( 2小时之内稳定 )4.4 考马斯亮蓝（G-250）法标准曲线绘制及待测液测量按照下表标记试管，分别加入试剂及材料，并用722-光栅分光光度计在595nm下用测定吸光度建立标准曲线。（注意！G-250对玻璃器皿有吸附，使用后需要用乙醇彻底清洁）管/mlBSA原液(ml)00.20.40.60.81.0待测液1各0.1ml待测液2各1ml蒸馏水 (ml)1.00.80.60.40.20各0.9mlG-250溶液各5ml，混匀，RT（室温）2min( 1小时之内稳定 )4.5紫外法标准曲线绘制及待测液测量按照下表标记试管，分别加入试剂及材料，并用UV9600紫外分光光度计在280下用测定吸光度建立标准曲线。并在280nm和260nm的波长下，测定待测液1和待测液2吸光度。管号12345678910111213141mg/mlBSA原液(ml)00.51.01.52.02.53.