电泳检测抗体纯度课件2012.12.3.ppt

电泳检测抗体纯度 林英 生物技术学院 2012.12.3 蛋白质的SDS电泳 原理： SDS是一种阴离子表面活性剂，其SO4-为亲水基，CH3（CH2）11-为疏水基。当蛋白质为水溶性时，不管蛋白质的种类是什么，大约1g的蛋白质将与1.4g的SDS结合，蛋白质将解离为多肽，其S-S键也在还原剂的作用下断裂，最终形成SDS-多肽，并带有大量过剩的负电荷。当利用聚丙烯酰胺凝胶进行电泳时，不管蛋白质的本来的形状和电荷如何，都将形成形状和电荷密度类似的SDS-多肽复合体，并根据其分子量的大小分离。 蛋白质的SDS电泳 试剂： 1、样品变性剂（3*）： 0.3M Tris.Hcl(pH6.8) 6% SDS 24% 甘油 12% 2-ME（巯基乙醇） 0.15% BPB30%（溴酚蓝） 蛋白质的SDS电泳 蛋白质的SDS电泳 蛋白质的SDS电泳 压缩胶试剂组成： 添加量(ml) 30:0.8丙烯酰胺/双丙烯酰胺 1.6 0.5M Tris.Hcl(pH6.8) 3 10% SDS 0.12 1.5%(w/v) APS(过硫酸胺) 0.3 TEMED 0.012 水 6.97 总量 12ml 蛋白质的SDS电泳 电泳缓冲液(10*) 0.1Mol/L Tri 0.768Mol/L 甘氨酸 0.5% SDS 蛋白质的SDS电泳 marker变性处理： marker 5ul 水 61ul 变性剂 33ul 蛋白质的SDS电泳 操作步骤： 1. 样品制备： ① 样品和变性剂按2：1比例混合后立即置于沸水溶中支架上5分钟； ② 样品冷却至室温，微型离心机短暂离心。 2、? 分离胶的灌注： ① 将制胶的装置、Teflon梳子、塑料隔条用强碱性去垢剂洗净、风干； ② 灌胶前用少量酒精将上述装置擦净； ③ 将玻璃板和隔胶条固定好，用琼脂封好边缘； ④ 分离胶各试剂充分混合，真空脱气10分钟，APS和TEMED在灌胶前再加； ⑤ 灌注胶液直至液面高度离玻板顶部约1.5cm处; ⑥ 在胶液上面均匀布一层异丁醇（2-甲基-1-丁醇），异丁醇可用水代替； ⑦ 分离胶至少聚合1小时。 3、压缩胶的灌注： ① 压缩胶的试剂混合、脱气方法同分离胶； ② 分离胶聚合后倾出上层液体异丁醇，用蒸馏水洗涤胶的上部； ③ 灌注压缩胶液； ④ 将梳子插入玻板之间； ⑤ 静置聚合30分钟。 4、电泳： ① 小心地取出梳子，上下槽中加入电泳缓冲液（1*），确保每个样品孔中都充满缓冲液； ② 除去样品孔中的气泡和聚丙烯酰胺碎片； ③ 每个样品按合适的蛋白质量加样，样品不要溢出样品孔外，避免蛋白质间互相混合； ④ 将电极导线接至电源，黑的接负极，红的接正极，电泳由负极向正极迁移； ⑤ 压缩胶部分每块按8mA(!5mA)电流，当溴酚蓝进入分离胶时，每块胶的电流增至18mA(30mA)； ⑥ 溴酚蓝迁移到胶的底部时，即关掉电源，停止电泳。 蛋白质染色 考马斯亮蓝染色 银染 负染法 荧光染色法 放射性同位素标记法 聚丙烯酰胺凝胶的考马斯亮蓝染色 原理： 考马斯亮蓝是一种色素，在酸性条件下与蛋白质结合，颜色从红褐色变成蓝色。 聚丙烯酰胺凝胶的考马斯亮蓝染色 试剂： 1、染色液（100ml） 考马斯亮蓝 R250 2.5g 甲醇 454ml 冰醋酸 92ml 水 454ml 2、 脱色液（1000ml） 甲醇 50ml 冰醋酸 75ml 水