胰岛素提取分离工艺.ppt

* 1.2 胰岛素提取分离工艺 1.2.1 胰脏低温保藏 1.2.2 组织捣碎及细胞破碎 1.2.3 提取 一 液固萃取分离法 二 固液分离方法 1.2.4 纯化与精制 一 沉淀法 二 柱层析法 三 浓缩 四 结晶 五 干燥 胰脏冷冻 胰脏刨碎成片 提取 碱化、酸化 减压浓缩 去脂、盐析 精制 一、胰脏冷冻 胰脏在冻结状态下粉碎，有利于细胞膜的破裂使之提取完全，并可避免蛋白水解酶对胰岛素的破坏。 二、胰脏刨碎成片 刨碎成片有利于与酸醇提取剂充分接触，增大提取率。 三、提取 1）pH为2.5~3.0（胰岛素在酸性条件下稳定） 2）乙醇含量为70%左右。（在此浓度下，胰岛素溶解度比较大，过高会使胰岛素变性） 3）温度为13~15℃（低温，保持胰岛素活性） 四、碱化、酸化 提取液在不断搅拌下加入浓氨水调pH值到8.0~8.4（温度13~15℃ ）立即进行过滤，除去碱性杂蛋白质，滤液应澄清，并及时用硫酸酸化至pH值到3.6~3.8.降温至5℃ 静置4小时以上，使酸性杂蛋白充分沉淀。 操作注意事项 去除杂碱性蛋白后应立即调溶液的pH值至酸性（在碱性条件下，胰岛素会散失活性，综合考虑去除杂蛋白的因素，故应立即调至酸性） 五、减压浓缩 吸上层清液至真空蒸发器内，下层用帆布过滤，沉淀物弃去，滤液并入上清液。清液在30℃以下减压蒸去乙醇，浓缩至浓缩液比重为1.04~1.06（约为原来体积的1/9~1/10）为止。 在这步操作中，主要是用来缩小溶液的体积，浓缩至一定的浓度，以便于下步的盐析操作。 六、去脂、盐析 浓缩液转入去脂锅，5分钟内加热至50℃，立即用冰盐水降温至5℃，静置3-4小时，分离出下层清液（脂层可回收胰岛素）。调pH值至2.3~2.5，于20~25℃在搅拌下加入27%（W/V）固体氯化钠，保温静置数小时，析出之物即为胰岛素粗品。 脂肪加热溶解，密度小，浮在上层液，迅速冷却将其去除 七、精制 1）第一次结晶 获得较纯的胰岛素，等电点结晶法，离心分离 2）第二次结晶 结晶、离心，同上 3）干燥 生物大分子制备得到所需的产品后，为了防止变质易于保存和运输，常需要干燥处理，最常用的方法是真空干燥和冷冻干燥，某些无活性核酸、微生物酶制剂和酪蛋白等产品则较多应用喷雾干燥、气流干燥等直接干燥法。 干燥可获得普通胰岛素，含有2~5%的杂质，包括胰岛素原、胰岛素二聚体、胰多肽等，层析时有A、B、C三个峰，C峰才是胰岛素。 4）柱层析 将结晶胰岛素经过凝胶过滤层析，胰岛素纯度达97%以上，此时在色谱图上仅占一个峰，故称单峰胰岛素。 经过凝胶过滤层析可获得单峰纯胰岛素，若将单峰胰岛素再用离子交换层析法进一步纯化，去除胰岛素原等杂质，使其纯度提高到99%以上。目前国内不能生产，尚依赖进口。其特点是：纯度高，副作用极少，生物效价高。 5）锌沉淀 在收集液中加入4mol氨水调pH值至6.2~6.4，加入3.6%（V/V）的醋酸锌溶液（此溶液浓度为20%），在用4mol氨水调pH值至6.0，低温放置过夜，离心得到沉淀。 6）第三次结晶 第三次等电点结晶，离心收集纯度高的胰岛素锌盐。 7）干燥 获得白色粉状胰岛素 8）制剂 胰岛素口服液能受胃肠消化酶分解而失效，因而必须制成注射液：有胰岛素注射液、蛋白锌胰岛素注射液、精蛋白锌胰岛素注射液等。 *