灭活原生质体融合选育α-ALDC高产菌株.pdfVIP

摘 要 摘 要 -乙酰乳酸脱羧酶可以去除啤酒中的双乙酰 在啤酒工业中有着广泛的应 用前景 双亲灭活原生质体融合技术优点较多 是原生质体融合育种中针对无遗 传标记同种不同株双亲的一种常用的有效方式 因此 对本实验室保存的两株产 -乙酰乳酸脱羧酶的枯草芽孢杆菌 Bacillus subtilis 进行双亲灭活原生质体融 合 筛选高酶活菌株 试验首先确定了比较适合的双亲菌株培养条件 选择使用了完全培养液和 发酵培养液两种培养基以及完全液体培养基20mL和40mL装液量 绘制了不同条 件下的生长曲线 确定了最佳培养条件是 将菌株由斜面接种到完全固体培养基 上 活化培养一天 再将其接种到液体完全培养基 37 200rpm摇床培养 14h最后按5%的接种量接种到20mL的液体完全培养基 继续活化3.5-4h将 培养好的菌体收集起来 进行溶菌酶处理 制备原生质体 本试验选择了多个溶 菌酶浓度 在 32条件下处理双亲菌株 通过绘制形成率和再生率曲线 认为 在32 用50g/mL的溶菌酶处理双亲菌株20min形成率较高 而且又有一 定的再生能力 适合融合 将制备的V-20原生质体进行紫外灭活 3226-5原生 质体进行热灭活 通过分析灭活后原生质体的融合率确定最佳融合条件是用 38 作用于混合菌液15min本试验共得到了900株 pH9.0的40%的PEG6000 融合子 将这些融合子传代 10次并测酶活 最后筛得3株菌 其酶解后的上清 液酶活高于亲株 试验最后通过对融合子与双亲菌株的DNA含量的简单比较 进 一步验证了筛得的菌株为融合子 关键词 枯草芽孢杆菌 -乙酰乳酸脱羧酶 灭活原生质体 融合 I Abstract Screening of -ALDC-higher-Producing Strains by Inactivated Protoplast Fusion Abstract -Acetolactate decarboxylase( -ALDC) which can remove diacetyl from the beer is used widely in beer industry. Inactivated protoplasts fusion method has more advantages in breeding techniques and also it has been used effectively in parents without any heritable labels. Bacillus subtilis V-20 and 3226-5 producing -ALDC are kept in our laboratory. The inactivated protoplast fusion method of Bacillus subtilis V-20 and 3226-5 is carried out to select some strains with higher enzyme activity of -ALDC. At the beginning of this test, the proper culture conditions of the parents are determined and the growth curve of two different culture solution (complete culture fluid