利用geNorm、NormFinder和 BestKeeper软件进行内参基因稳定性分析的方法.docVIP

利用geNorm、NormFinder和 BestKeeper软件进行内参基因稳定性分析的方法 　　摘要 实时荧光定量PCR（RT-qPCR）由于具备灵敏度高、重复性好、特异性强及高通量等优点，已经成为研究基因表达分析的常用方法，但其结果的准确性取决于内参基因。在任何试验条件下都能稳定表达的内参基因几乎不存在，科研工作者为了获得精准的试验结果，首先必须从众多的内参基因中筛选出稳定的内参基因。geNorm、NormFinder和BestKeeper等是专门用于筛选稳定性内参基因的软件，但这3种软件使用方法差异很大，为了让更多的科研人员了解这些软件、节省时间，笔者结合自己的科研经验详细介绍了这3种软件的使用方法，以期为相关科研人员利用这些软件筛选内参基因提供便利。 　　关键词 内参基因；稳定性分析；geNorm；NormFinder；BestKeeper 　　中图分类号 S60 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2017）05-0278-04 　　Abstract Real-time fluorescent quantitative PCR technology（RT-qPCR） is used for gene expression analysis with high sensitivity，good repea-tability，strong specificity，high throughput，but the veracity and reliability results depend on whether select appropriate reference gene or not.However，no universally applicable reference genes with an invariant expression are available.In order to obtain accurate results，appropriate reference genes for RT-qPCR normalisation must systematically evaluate the stability of candidate reference genes prior to using in each experimental system.geNorm，NormFinder and BestKeeper are useful programs to identify appropriate reference genes for RT-qPCR analysis，but the methods for using the three softwares were different.In order to save the time to understanding the way to use them and provide convenient for new researchers，this study described the methods of application. 　　Key words reference gene；stability analysis；geNorm；NormFinder；BestKeeper 　　??时荧光定量PCR（RT-qPCR）由于具备灵敏度高、重复性好、特异性强及高通量等优点，已经成为研究基因表达分析的常用方法[1-2]。实时荧光定量PCR分为绝对定量和相对定量，在进行相对定量分析时不需要已知量的标准品，因而该方法被经常运用，但该方法需要用内参基因对目的基因进行数据校正，才能获得精确的结果[3-4]。 　　肌动蛋白基因（ACT）、3-磷酸甘油醛脱氢酶基因（GAPD 　　H）、18S rRNA、转录延伸因子基因（EF-1α）、多聚泛素酶基因（UBQ）、α微管蛋白基因（TUA）和β微管蛋白基因（TUB）等看家基因在之前的研究中常常被当作内参基因进行使用[5-8]。然而，越来越多的研究表明，在某种试验稳定表达的内参基因，在另一种试验中有可能是变化的[9-11]，而在任何试验条件下都能稳定表达的内参基因几乎不存在[12-13]。如果仅仅根据文献报道使用某个常用的内参基因，不仅可能导致试验结果的不准确性，甚至可能导致结论的错误。因此，本着严谨的科学态度，科研工作者首先必须从众多的内参基因中筛选出在各自试验条件下较为稳定的内参基因。 　　geNorm、NormFinder 和 BestKeeper是专门用于筛选内参基因稳定性的软件，但这3种软件的使用方法和分析的侧重点各不一样，为了让相关科研人员快速了解并掌握这3种软件