微生物催化不对称水解制备（-）γ-内酰胺的研究.pdf

摘 要 摘 要 光学纯的(-)γ- 内酰胺可用于合成碳环核苷类化合物,是重要的抗艾滋病药物阿巴卡 韦的手性中间体。本文筛选获得具有高立体选择性和稳定性的(+)γ- 内酰胺酶产生菌株， 并研究其微生物全细胞催化不对称水解制备(-)γ- 内酰胺。 通过两步筛选法对土壤中的菌株进行筛选，以 N- 乙酰L-苯丙氨酸为底物进行初筛， 对筛选出来的菌株进行拆分(±)γ- 内酰胺能力的测定。经过手性HPLC 检测，筛选出一株 具有高立体选择性和酶活的(+)γ- 内酰胺水解酶产生菌株。通过 16s rRNA 基因序列比对 分析，鉴定该菌株为 Delftia sp.，保藏于中国普通微生物菌种保藏中心，保藏号为Delftia sp. CGMCC No. 5755 。 在摇瓶水平上考察了碳氮源、无机盐离子以及诱导剂等对 Delftia sp.菌体生长和发 酵产酶的影响，确定最适发酵培养基组成(g/L)：蔗糖 30 ，蛋白胨 30 ，牛肉膏 25 ， 乙酰胺 5 ，MgSO4 1；最适培养条件为：温度30 ℃，初始pH 7.0 ，接种量为 1%。该菌 株在优化的条件下发酵培养 20 h ，酶活达到最大值 692 U/L，生物量2.74 g/L 。对Delftia sp.菌株进行了3 L 罐发酵培养，培养24 h 的菌体具有最佳的转化活力和较高的光学纯度， 酶活达到最大值 739 U/L，生物量2.82 g/L 。 对微生物催化不对称水解拆分(±)γ- 内酰胺的条件进行了优化：最适 pH 范围为 7.0-7.5，温度为 35 ºC，摇床转速为 180 rpm，菌浓40 g/L 。当底物浓度为 100 g/L 时， 在优化条件下反应 12 h，e.e.值和产率分别为 99.9%和 53.7%，对映选择率 E 值可达 99.2 。 考察了底物浓度对水解反应的影响，实验结果表明底物对细胞有抑制作用。通过分批添 加底物可以减轻底物的抑制作用并提高底物的转化率。各种添加剂对水解反应没有明显 的促进作用，有机溶剂对(+)γ- 内酰胺酶的活性和立体选择性没有显著的影响。 研究了利用新型双水相萃取体系对产物(-)γ- 内酰胺进行提取。通过测定多种双水相 体系的萃取能力，结果表明磷酸氢二钾/ 乙醇体系的萃取效果较好。对磷酸氢二钾/ 乙醇 双水相体系的操作工艺进行优化，双水相体系中醇、盐的浓度对(-)γ- 内酰胺的收率有显 著的影响。当 K HPO 浓度为 22% ，乙醇浓度为 19%，(-)γ- 内酰胺回收率为96.95%，纯 2 4 度为 83.36%。为得到纯度较高的(-)γ- 内酰胺，对其进行了有机溶剂萃取的研究，最终采 用二氯甲烷对产物进行萃取，产物纯度达到 97.48% 。将反应体系放大到 700 ml，菌体 浓度为 40 g/L ，底物浓度为200 g/L ，底物分六次添加，反应 30 h 。产物的e.e.值 99.14%， 转化率为 54.82%，对映选择率 E 值为 52.5 。用等体积二氯甲烷萃取 3 次后，通过蒸发 结晶，产生的淡黄色固体(-)γ- 内酰胺，产物的回收率为79.56% 。产物经HPLC 检测，e.e. 值和纯度分别为 99.64%和 94.35% 。对纯化的产物进行核磁(NMR)鉴定确认其为(-)γ- 内 酰胺。 关键词：生物催化；不对称水解；Delftia sp. ；(-)γ- 内酰胺；双水相体系 I Abstract Abstract (-)γ-Lactam is one of the key starting materials for the synthesis of carbocyclic nucleosides, and serves as an important chiral i