微生物转化井冈霉素制备假氨基糖类α-糖苷酶抑制剂的研究.pdf

论文题目：微生物水解井冈霉素制备氨基假糖类α-糖苷酶抑制剂的研究 学科专业：微生物学 学位申请人：牟尧 指导教师：茅仁刚 中文摘要 中文摘要 中文摘要中文摘要 α-糖苷酶抑制剂在糖尿病治疗中发挥着重要作用，井冈胺作为α-糖苷酶抑 制剂以及合成降糖药物的中间体，有着重要的药用价值和广阔的市场前景。由于 井冈胺的化学合成工艺复杂，步骤繁多，利用生物转化制备井冈胺已成为当下研 究热点。本论文利用生物农药井冈霉素为原料，对利用微生物转化井冈霉素制备 井冈胺进行了系统研究。 本文通过碱水解阿卡波糖的方法制备井冈胺粗品，利用 732 阳离子交换树 脂和 DOWEX 1 ×2 阴离子交换树脂纯化井冈胺粗品以制备井冈胺标准品。对井冈 胺的 TLC 及 HPLC 检测条件进行了优化，优选出井冈胺的 TLC 检测条件为：展开 剂：正丙醇：冰乙酸：水=4:1:1 ；显色剂：1%茚三酮溶液；显色方法：。对井冈 胺柱前衍生化反应条件的研究结果表明：随着温度和时间的增加，衍生化反应程 度更为充分，最终优选出的衍生化反应条件为：反应体系为：1%对氟硝基苯和 1.5%三乙胺的二甲基甲酰胺溶液；反应水浴温度 100℃；反应时间 60min 。衍生 化产物 HPLC 检测的优选条件为：色谱柱：Phenomenex Gemini C18 色谱柱；流动 相：乙腈-水（15:85）；柱温：30℃；流速：1ml/min；检测波长：398nm 。 利用采自不同区域的 20 份土样，在井冈霉素作为唯一碳源的培养基中进行 转化菌株筛选，从中分离出细菌 59 株，真菌 23 株。以底物井冈霉素消耗量和产 物井冈胺生成量为指标，采用 TLC 对 82 种微生物进行初筛，得到 2 株具有转化 井冈霉素生成井冈胺的细菌。再以井冈胺产量为指标进行 HPLC 复筛，最终得到 一株具有较高转化能力的菌株，编号为 Vali-2 。 利用形态学观察、生理生化实验以及分子生物学方法对菌株Vali-2 进行鉴定。 通过形态学观察，Vali-2 为芽孢杆菌。Vali-2 菌株生理生化实验研究表明，该菌为 革兰氏阴性菌，菌株具有还原硝酸盐，液化明胶的能力；菌体可发酵葡萄糖产酸， 但不产气；不可利用柠檬酸盐；菌体产生淀粉酶，过氧化氢酶；甲基红反应为阴 性，VP 反应结果不确定。分子生物学测序鉴定菌株 Vali-2 为芽孢杆菌属 Bacillus oleronius 。最终鉴定菌为芽孢杆菌属 Bacillus oleronius。 对菌株Vali-2 转化井冈霉素产井冈胺的培养基组成和摇瓶发酵条件进行了初 步优化，结果优选培养基为：蛋白胨 1%、酵母浸粉 0.5%、氯化钠 0.5%、磷酸氢 二钾 0.7%、磷酸二氢钾 0.3%、无水磷酸镁 0.01% 。最佳转化条件为：底物井冈 霉素浓度 1%，培养液初始 pH8.0，培养时间4d ，装液量 50/250ml，接种量 15%。 在此转化条件下井冈霉素的转化率最高，产物井冈胺的产量最高。 关键词：关键词：井冈霉素; 井冈胺; 菌株筛选; 分类鉴定; α-糖苷酶抑制剂; 生物 关键词关键词：： 转化 Abstract Inhibitors of alpha-glucosidase play an important role in the treatment of diabetes. Valienamine, a potent alpha-glucosidase inhibitor