对节白蜡ISSR―PCR反应体系的建立与优化.docVIP

对节白蜡ISSR―PCR反应体系的建立与优化 　　摘要：以对节白蜡（Fraxinus hupehensis Chiú，Shang et Su）基因组DNA为材料，采用正交试验和单因子试验对其ISSR-PCR反应体系进行了构建与优化。结果表明，在15 μL反应体系中含DNA模版40 ng、引物终浓度0.7 μmol/L、7.5 μL 2×Taq PCR Plus Master Mix的扩增效果最好。该反应体系筛选出了14条稳定性强、多态性高、扩增效果较好的ISSR引物，并通过梯度PCR试验比较引物在不同退火温度下的扩增效果，从而确定引物最佳退火温度。 　　关键词：对节白蜡（Fraxinus hupehensis Chiú，Shang et Su）；ISSR-PCR；反应体系；单因子试验；正交设计 　　中图分类号：Q78；Q943.2 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2016）22-5962-04 　　DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.22.058 　　Establishment and Optimization of Fraxinus hupehensis ISSR-PCR Reaction System 　　CHENG Jian-ru， ZHOU Ming-qin 　　（College of Horticulture and Landscape Architechture，Yangtze University，Jingzhou 434025，Hubei，China） 　　Abstract：The single factor test and orthogonal design were used to establish and optimize the ISSR-PCR reaction system of Fraxinus hupehensis Chiú，Shang et Su. The results showed that the appropriate PCR reaction system consisted of 40 ng template DNA，0.7 μmol/L primer，and 7.5 μL 2×Taq PCR Plus Master Mix.14 high-efficient polymorphic primers were screened out based on the optimal ISSR reaction system.Furthermore，the ideal annealing temperature of the every selected primer was decided according to the amplified results with different temperatures. 　　Key words：Fraxinus hupehensis； ISSR-PCR； reaction system； single factor test； orthogonal design 　　对节白蜡（Fraxinus hupehensis Chiú，Shang et Su）为木犀科白蜡属的落叶乔木，又名湖北白蜡、对节树、湖北?q，特产于湖北省，1990年被正式定为国家二级珍稀濒危保护植物[1]。该种仅分布于湖北省钟祥与京山接壤地区，多生长在海拔100～600 m的土层深厚的山坡、沟谷、水积平台及村边路旁，在群落中多沿山坡向沟谷逐渐加大，甚至形成小片纯林[2]。该物种生长缓慢，具有很高观赏价值；材质优良，既是珍贵的用材树种，又是优美的园林绿化树种，还是极佳的盆景、根雕素材，被誉为“活化石”或“盆景之王”，此外还具有很高的药用价值。近年来，由于重利用轻保护，乱砍滥伐，尤其是为制作树桩盆景，节白蜡野生资源遭到过度采挖，破坏严重。因此，了解对节白蜡野生资源的现状，加强基础研究，探讨其濒危机制，制定资源保护与合理利用之对策已属当务之急。 　　目前，有关对节白蜡的研究较少，主要集中在资源调查[3]、育苗技术[4]、植物组织培养[5]、化学成分和药理作用[6]等几个方面。但有关对节白蜡分子遗传标记的研究国内外尚未见报道。ISSR（Inter-simple sequence repeat），又称为Inter-SSR，即简单重复序列区间，属于第二代DNA分子标?，是Zietkiewicz等[7]于1994年在SSR标记基础上发展起来的。ISSR技术是利用在植物基因组中常出现的SSR本身设计引物，使位于反向排列、间隔不太大的重复序列间的基因组片段进行PCR扩增。由于SSR在真核生物中分布广泛，且串联重复的