从RNA抽提到电泳鉴定.PDF

1 从 RNA 抽提到电泳鉴定 2005.6 Pgming2004 2 RNA 抽提 一，准备工作 1，实验器具与材料： （1） 移液枪：1ml、200ul 、10ul （2 ） 吸头：1ml、200ul 、20ul （3 ） 吸头台：放置 1ml 吸头的一个，放置 200ul 和 20ul 的吸头一个 （4 ） EP 管 1.5ml、100ul （5 ） 玻璃研磨器 （6 ） 容量瓶：1000ml （7 ） 盐水瓶：100ml （8 ） 15ml 塑料管一个（配 75 ％乙醇用） 2 ，实验器具的处理与准备 （1） 塑料制品：（包括吸头、EP 管等） 将塑料制品逐个浸泡于 1‰DEPC 水中（必要时小枪头需要用吸管打入 DEPC 水）37℃过夜，然后送至高压 3 次，后在 80℃烘烤箱中烘干（或置于 37℃中 8 小时左右烘干），试验前将枪头放入吸头台。 （2） 玻璃制品：（主要是玻璃研磨器） 先泡酸过夜，冲洗干净后，在 1‰DEPC 水中泡 8 小时左右，37℃烘干，用蒙锡 纸包裹送至干烤 3 次。 （3 ） 金属制品：（镊子等） 先洗干净，再送干烤 3 次。（不需要泡 DEPC 水） 3，试剂配制和准备： （1） DEPC 水：泡实验器具的 DEPC 水的配制：1000ml 双蒸水中加 1mlDEPC，放在 1000ml 容量瓶中静置 4 小时后备用。配 75 ％乙醇的 DEPC 水的配制：100ml 盐水瓶内装 40ml 双蒸水，加 40ulDEPC ，37℃过夜，送至高压。 （2 ） 75 ％乙醇（要在抽提时现配）：用无水乙醇和 DEPC 水配制（DEPC 水:无水乙 醇＝1:3），然后放于-20℃备用。 （3 ） 异丙醇：放入棕色瓶 （4 ） 氯仿：放入棕色瓶 （5 ） Trizol：100ml/瓶 存放于 4℃ 二，抽提时注意事项： 全程佩戴一次性手套和口罩，手套要勤换，避免戴上的一次性的手套接触可疑污染物。 三，抽提步骤 1．匀浆化作用 取约 100mg 鼠脑组织放于玻璃研磨器内，先加0.2ml 的 Trizol 溶液，研磨组织后，倒 入 1.5mlEP 管中，再在研磨器内加入 0.8ml 的Trizol 溶液洗，后全部再倒入 EP 管中。 颠倒混匀 10 下，室温静置 5 分钟。 2 ．分离阶段 每 1mlTrizol 中加0.2ml 氯仿。盖紧样品管盖，用手用力摇晃试管 15 秒，使其充分混匀， 室温静置 5 分钟。后 12000rmp 离心 15 分钟。 3 ．RNA 的沉淀 将上层水相转入新的 1.5mlEP 管中（约 400-500ul ），加入 0.5ml 异丙醇，混匀后放于-20 ℃中 1 小时，后 12000rmp 离心 10 分钟。 3 4 ．RNA 的洗脱 小心倒掉上清，留取沉淀。加 1ml 现配的 75%的乙醇（预冷）振荡洗涤RNA 沉淀一次， 后 7500rmp 离心 5 分钟。 5 ．RNA 的再溶解 小心倒掉上清，取沉淀置超净工作台开风机吹干（约 30 分钟，此时 RNA 沉淀变透明）。 注意不能让 RNA 沉淀完全干燥（会极大地降低它地可溶性）。再在管中加 20ul 的DEPC 水溶解，在 55-60℃