细胞生物学教研室.PPT

第三章 细胞生物学的研究方法。。。。。和手段。 本章内容： 第一节 显微镜技术 第二节 细胞的分离和培养 第三节 细胞组分的分离和纯化技术 第一节 显微镜技术 显微镜是观察细胞的主要工具。 根据光源不同，可分为两大类： 光学显微镜（light microscope） 电子显微镜（electron microscope） 分辨率（Resolution）： 显微镜或人眼在25cm的明视距离处所能分辨的两个质点间的最小距离。 一、分辨率可达0.2 μm的光学显微镜技术 常用种类： 普通光学显微镜 荧光显微镜 相差显微镜 暗视野显微镜 共聚焦激光扫描显微镜 微分干涉差显微镜 …… （一）普通光学显微镜 构成： ①照明系统 ②光学放大系统 ③机械装置 成像原理：经物镜形成倒立实像， 经目镜放大成虚像。 分辨率（R）： 光镜样本的制备 固定：可使大分子交联而保持在一定位置上，防止在以后的染色等处理过程中移位或丢失。 常用的固定液：甲醛、戊二醛 包埋：组织硬化 便于切片 防止样品移位 切片：切成1—10um的薄片 染色 （二）荧光显微镜技术 — 研究分子在细胞内定位 荧光分子 荧光显微镜与普通显微镜在构造上的区别 照明方式通常为落射式 光源为短波光（一般是紫外光），分辨力高于普通显微镜。 有两个特殊的滤光片 （三）相差显微镜 —— 直视活细胞 特点：可以直接观察未经染色的活细胞 原理： 倒置相差显微镜 光源和聚光镜在载物台的上方 相差物镜在载物台的下方 用于观察培养的活细胞 （四）暗视野显微镜 —— 观察物体轮廓 特点：适于观察物体的轮廓，但分辨不清 内部的微细构造. 应用：适合于观察活细胞内的细胞核、线粒 体、液体介质中的细菌和真菌等。 （五）显微电影摄影技术 ——记录细胞或细胞器的运动过程和速度 (六) 共聚焦激光扫描显微境 —显示细胞内的3D结构 原理 设计原理 电子波长比光波短得多（10万伏特电压加速的电子，波长约0.004nm），用电子波代替光波可提高显微镜的分辨率。 电子显微镜的分辨率 放大倍率：可达近百万倍 显示的结构：亚显微结构或超微结构 两大类：透射电镜（即通常所指的电镜） 扫描电镜 电子显微镜与光学显微镜的基本区别 （一）透射电子显微镜（ transmission electron microscope, TEM ） 主要用于观察细胞内部的细微结构 总体设计与光镜类似，主要的不同之处： 体积大 上下颠倒 用电子束作光源 用电磁场作透镜 镜筒真空 透射电镜的标本制备 取材:尽可能保持生活状态,避免损伤 固定: 常用戊二醛和四氧化锇（锇酸）双重固定 脱水：系列梯度的乙醇或丙酮 有利于包埋 包埋：常用环氧树脂,使样品固化成硬块 切片：电子穿透力很弱，需将样品用超薄切片机切成50～100nm厚的超薄切片。 重金属染色 常用的染色剂：醋酸铀，枸橼酸铅 高压透射电镜 电源加速电压＞20万伏特 超高压电镜：电源加速电压＞50万伏特 优点： 电子穿透力增强，可观察较厚的电镜切片 电子波长短，分辨率高 （二）扫描电子显微镜技术（ scanning electron  microscope, SEM ） 20世纪60年代问世，比透射电镜小，结构简单 成像原理 扫描电镜的特点 ① 可以直接观察标本表面的三维形态，图像的 立体感很强 ② 放大倍率范围广，可放大十几倍到几十万倍 ③ 样品制备简单，不必做超薄切片 ④ 分辨率比透射电镜低 一般介于光镜与透射电镜之间，可达3nm。 近几年研制的低压高分辨扫描电镜分辨率 可达0.7nm，可用于观察核孔复合体等更精 细的结构。 （三）金属投影、冰冻断裂及冰冻蚀刻技术 —— 常见的电镜制样技术 断面的处理方法： 不蚀刻（no etching ） 蚀刻（ etching ） 冰冻蚀刻 第二节 细胞的分离和培养 ⑴ 制备单个细胞悬液 经典方法： 胰蛋白酶或胶原酶: 消化细胞外基质 EDTA（乙二胺四乙酸）:破坏细胞间连接 ⑵ 从细胞悬液中分离不同类型细胞 ① 离心沉降：将大小、形状和密度不同的细胞分开 ② 利用一些细胞对玻璃或塑料具有较强的粘附力, 将其与其他细胞分开 ③ 利