蛋白质的化学(下).ppt

* * 在碱性环境下蛋白质与Cu2+络合并将其还原成Cu+。BCA与Cu+结合形成稳定的蓝紫色复合物，在562nM处有高的吸光值并与蛋白质浓度成正比。 BCA法测蛋白浓度： * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * (二) 蛋白质的分子形状 根据扩散系数、黏度或其他物理方法等可以推算出蛋白质的不对称常数 ≈1 分子呈球形 1 分子呈椭球形 1 分子呈纤维状 蛋白质是一类高分子化合物，其在溶液中的形状可根据不对称常数分为球形、椭圆形、纤维状等。 (三) 蛋白质分子量的测定 Western blot 二、蛋白质的变性与复性 变性 复性 变性 ：某些物理的和化学的因素使蛋白质分子的空间构象发生改变或破坏，导致其生物活性的丧失和一些理化性质的改变。 复性：蛋白质的变性作用如果不过于剧烈，则是一种可逆过程，变性蛋白质通常在除去变性因素后，可缓慢地重新自发折叠成原来的构象，恢复原有的理化性质和生物活性。 蛋白质变性的学说最早由我国生化学家吴宪(1931)提出，他认为天然蛋白质分子受环境因素的影响，从有规则的紧密结构变为无规则的松散状态，即变性作用。 变性的本质 蛋白质结构内部的次级键受到破坏，从而导致蛋白质分子空间构象的改变或破坏，而不涉及一级结构的改变或肽键的断裂。 变性的特征 (1)生物活性的丧失 (2)某些理化性质的改变 ： 溶解度；结晶能力；黏度；不对称性；易水解 变性的因素和程度 物理因素： 高温、紫外线、X-射线、超声波和剧烈振荡等； 化学因素： 强酸、强碱、尿素、去污剂、重金属(Hg2+、As+、Pb2+)、三氯醋酸、浓乙醇等 如除去变性因素后，蛋白质构象可恢复者称可逆变性；构象不能恢复者称不可逆变性。 变性的应用 eg.酒精、紫外线消毒，高温、高压灭菌等是使细菌蛋白变性而失去活性； 中草药有效成分的提取或其注射液的制备也常用变性的方法(加热、浓乙醇等)除去杂蛋白； 在制备有生物活性的酶,蛋白质, 激素或其他生物制品(疫苗、抗毒素等)时，要求所需成分不变性，而不需要的杂蛋白应使其变性或沉淀除去。此时，应选用适当的方法，严格控制操作条件，尽量减少所需蛋白质变性。有时还可加些保护剂、抑制剂等以增强蛋白质的抗变性能力 pH = pI 净电荷=0 pH pI 净电荷为正 pH pI 净电荷为负 Pr COOH NH3+ + H+ + OH- + H+ + OH- Pr COO- NH2 Pr COO- NH3+ 三、蛋白质的两性电离与等电点 蛋白质与氨基酸一样在纯水溶液和结晶状态中都以两性离子的形式存在，即同一分子中可带有正负两种电荷，羧基带负电而氨基带正电。 使蛋白质所带正负电荷相等，净电荷为零时溶液的pH，称为蛋白质的等电点。 四、蛋白质的胶体性质 + + + + + + + 带正电荷的蛋白质 － － － － － － － － 带负电荷的蛋白质 在等电点的蛋白质 不稳定的蛋白质颗粒 酸 碱 酸 碱 脱水作用 蛋白质具有如布朗运动、光散射现象、不能透过半透膜以及具有吸附能力等胶体溶液的一般特征。 水化层 蛋白质水溶液是一种比较稳定的亲水胶体。蛋白质形成亲水胶体有两个基本的稳定因素：1、表面具有水化层 2、表面具有同性电荷 。 Company Logo 蛋白质胶体性质的应用 透析法:利用蛋白质不能透过半透膜的的性质，将含有小分子杂质的蛋白质溶液放入透析袋再置于流水中，小分子杂质被透析出，大分子蛋白质留在袋中，以达到纯化蛋白质的目的。这种方法称为透析（dialysis）。 盐析法:在蛋白质溶液中加入高浓度的硫酸铵、氯化钠等中性盐，可有效地破坏蛋白质颗粒的水化层。同时又中和了蛋白质表面的电荷，从而使蛋白质颗粒集聚而生成沉淀，这种现象称为盐析（salting out）。 盐溶: 加入少量中性盐可增大蛋白质溶解度的现象。 五、蛋白质的沉淀反应 1. 盐析 (高浓度中性盐，不变性) 2. 有机溶剂沉淀 3. 加热变性沉淀 4. 重金属盐沉淀 5. 生物碱试剂沉淀 (或某些酸类) 沉淀= or ≠ 变性？ 蛋白质变性有时可表现为沉淀，亦可表现为溶解状态；同样，蛋白质沉淀有时可以是变性，亦可以不是变性，这取决于沉淀的方法和条件以及是否对蛋白质空间构象有无破坏而定。 六、蛋白质的颜色反应 反应名 试 剂 颜色 反应基团