空肠弯曲杆与菌分子生物学鉴定.pptVIP

空肠弯曲杆菌分子生物学检测方法研究进展 一、空肠弯曲杆菌简介 二、DNA环介导恒温扩增法 三、DNA环介导恒温扩增法检测空肠弯曲 杆菌 四、研究意义 五、前人研究进展 六、拟解决的关键问题 一、空肠弯曲杆菌简介 空肠弯曲杆菌（Campylobacter jejuni, C. jejuni)作为一种食源性人畜共患病的病原体，越来越受到国内外高度重视。 近年来，空肠弯曲杆菌感染率在世界各地普遍呈上升趋势。 空肠弯曲杆菌系弯曲杆菌属的一个种，弯曲杆菌属细菌分为两类：一类是25℃生长，42℃不生长的细菌；另一类为25℃不生长，42℃生长的细菌。 空肠弯曲杆菌在弯曲杆菌属中最为常见，是引起人类细菌性胃肠炎的主要病原菌之一。 空肠弯曲杆菌为多形性，呈弧形，螺旋形、海鸥展翅形或S形。革兰氏染色阴性。 空肠弯曲杆菌在外环境下的存活力取决于温度，4℃时在水、粪便、尿、牛奶中可存活几周，25℃时只能存活几天或更短的时间。对热敏感，58℃经过5分钟即可杀灭，另外阳光直射及消毒剂也有很好的杀灭效果。 空肠弯曲杆菌为微需氧菌，在大气或厌氧的环境中不能生长。 空肠弯曲杆菌作为共生菌大量存在于各种野生或家养动物的肠道内，与人体感染较为密切的主要为家畜和家禽，家禽已从鸡、鸭、鹅、火鸡等家禽的粪便、胆汁、泄殖腔内容物中分离到该菌，感染率高，带菌期长，可长达18个月。 分子生物学检测方法 常规生化检测方法 血清学方法 PCR方法（定性PCR方法 荧光定量PCR方法） 环介导恒温扩增法 二、DNA环介导恒温扩增法 DNA环介导恒温扩增(LAMP)反应，是分子生物学领域中的一个新概念，它可以在恒温（60～65℃）条件下，30～60min内将只有几个拷贝的靶核酸扩增到10⒐水平 该方法的一大特色是，可以通过反应副产物——白色焦磷酸镁沉淀的产生与否判断靶基因的存在。 DNA环介导恒温扩增用于病原微生物（如空肠弯曲杆菌）的鉴定具有高效率、高特异性、高敏感性等特点。 LAMP方法在食品安全检测、流行性病毒检测、临床诊断等领域的应用及研究均有文献报道。 LAMP方法已具有成功应用的现实性，为快速基因的检测提供了一种新的技术途径，比PCR方法更具推广性，可望作为常规检测的工具。 2000年，Notomi等开发出一种新的DNA环介导的恒温扩增法（loop-mediated isothermal amplification of DNA, LAMP）。 LAMP方法利用Bst大片段DNA聚合酶和根据不同靶序列设计的两对特殊的内引物（FIP由F1C和F2组成；BIP由BIC和B2组成）、外引物（F3和B3），特异地识别靶序列上的6个独立区域。 FIP引物的F2序列与靶DNA上互补序列配对，启动循环链置换反应。F3引物与模板上的F3C区域互补，引起合成与模板DNA互补的双链，从而挤掉FIP引起的DNA单链。 与此同时，BIP引物与被挤掉的这条单链杂交结合，形成的环状结构被打开，接着，B3引物在BIP外侧进行碱基配对，在聚合酶的作用下形成新的互补链。 被置换的单链DNA两端均存在互补序列，从而发生自我碱基配对，形成类似哑铃状的DNA结构。LAMP反应以此DNA结构为起始结构，进行再循环和延伸，靶DNA序列大量交替重复产生，形成的扩增产物是有许多环的花椰菜形状的茎-环结构的DNA，数量级可达10⒐ DNA环介导恒温扩增反应原理示意图 LAMP方法特点 扩增反应易进行和扩增产物方便、快捷鉴别 LAMP反应特异性强、灵敏度高 实验装置简单 三、DNA环介导恒温扩增法检测空肠弯曲杆菌 拟建立一种DNA环介导恒温扩增法来检测空肠弯曲杆菌 与PCR扩增方法类似，根据反应的副产物是白色焦磷酸镁沉淀，可肉眼观察，来鉴定反应是否进行。 LAMP扩增产物可以像PCR反应一样利用凝胶电泳并结合成像系统进行检测。 利用LAMP方法检测空肠弯曲杆菌，不仅可以对反应结果进行定性，而且还可以通过利用焦磷酸镁沉淀的产生量与DNA的生成量之间的线性关系，对反应的DNA进行定量。 四、研究意义 预防和控制空肠弯曲杆菌病在我国的流行，不但具有重要的经济意义，更重要的是将在我国社会发展中起重要作用，具有重大的社会意义。只有对空肠弯曲杆菌流行分布状况进行全面系统地调查研究，搞清其感染率和发病率，掌握其耐药谱，才能准确地预测其流行趋势。 空肠弯曲杆菌广泛存在于动物机体，很容易对集约化养殖中普遍应用的抗菌药物产生耐药性，且这种耐药性很容易通过食物等途径转移给人类，直接威胁人类健康。因此对空肠弯曲杆菌的检测具有重要的公共卫生学意义。 五、前人研究进展 一般对空肠弯曲杆菌的检测大多采用PCR方法。 利用DNA环介导恒温扩增法检测了如金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、志贺杆菌、李斯特菌等，前人均有文献报道。 王福厚等