纸电泳法分与离单核苷酸.pptVIP

纸电泳法分离单核苷酸 实验目的 学习电泳技术的基本原理 了解RNA碱水解的原理 掌握纸电泳分离单核苷酸的原理和方法 什么是电泳？ 带电物质在电场中可以向其所带电荷相反的电极移动的现象称电泳。 电泳分离生物大分子的原理： 由于混合物中各组分所带电荷性质、电荷数量以及分子量的不同，在同一电场的作用下，它们泳动的方向和速度也不同。因此，在一定时间内各组分移动的距离不同，从而达到分离和鉴定的目的。 生物大分子在电场中受到的作用力 在电场中，推动带电质点运动的力（F）等于质点所带净电荷量（Q）与电场强度（E）的乘积。 F＝EQ 质点的前移同样要受到阻力（f ）的影响，对于一个球形质点，服从Stoke定律，即： f＝6π r ην（r为质点半径，η为缓冲液的粘滞系数，ν为质点移动速度） v=EQ /6πrη 影响V的因素 颗粒本身：带电、大小、形状 外界因素：电场强度E、缓冲液pH、离子强度I、电渗、支持介质的筛孔等。 电泳技术的分类 自由电泳（无支持体）：等电聚焦电泳、等速电泳及密度梯度电泳等； 区带电泳（有支持体）：滤纸电泳（常压及高压）、薄层电泳（薄膜及薄板）、凝胶电泳（琼脂、琼脂糖、淀粉胶、聚丙烯酰胺凝胶）等。 实验原理 RNA的水解 RNA在酸、碱和核酸酶的作用下，发生水解，降解成为多核苷酸和单核苷酸等产物。 RNA用酸水解可得到嘧啶核苷酸和嘌呤碱基； 用碱水解，经过2’、3’一环核苷酸中间物，可得到2’一核苷酸和3’一核苷酸的混合物； 用5‘一磷酸二酯酶或3’一磷酸二酯酶水解则分别可得到3‘一核苷酸或5’一核苷酸。 常用的是碱水解：0.5M的KOH在37℃作用16～24h，即可得到单核苷酸，再用HCLO4中和，除去K+。 实验原理 电泳 碱水解得到的A、U、G、C单核苷酸，是两性电解质，在一定PH值条件下所带电荷多少不同，可用纸电泳的方法进行分离。 四种核苷酸的解离曲线 实验方法 点样 在距滤纸边缘10cm的地方用铅笔画一直线，两侧各间隔1.5cm做一个记号（A、U、G、C和RNA），共5点 毛细管点样，标准品点4次，RNA样品点8次，在边上点上一滴苦味酸 注意： 尽量不要用手接触滤纸，点样直径不超过4mm，点一次用吹风机热风吹干后再点第二次 实验方法 2. 电泳 将滤纸平整放在电泳槽的塑料架上，纸两端垂于缓冲液中，用滴管湿润滤纸，最后湿润点样处。 点样端接负极，电压600V，电泳大约1h。 注意： 样品处不要接触塑料架，滤纸上不要有水洼。 结果观察 取出滤纸，用电吹风热风吹干，在紫外灯下观察结果，并画出图谱。 值日生11和12组 * CMP 环状磷酸二酯 胞嘧啶核苷酸的解离 pKa1＝第一磷酸基的pK pKa2＝碱基含N环的pK -0.16 -0.95 -1 -0.46 静电荷 +0.84 -1 CMP +0.05 -1 GMP +0 -1 UMP +0.54 -1 AMP 氨基的电荷 磷酸基电荷 核苷酸 UMPGMPAMPCMP 试剂和器材 电泳仪 新华1号滤纸 毛细管 电吹风 紫外检测仪 A、U、G、C四种标准核苷酸 RNA样品 PH3.5柠檬酸钠缓冲液