限制性内切与酶.pptVIP

不同的限制性内切酶的最适反应温度不同。大多数是37oC，少数要求40-65oC。 酶 最适 温度oC 酶 最适 温度oC 酶 最适温度oC Apa I Bcl I Mae II Taq I 30 50 50 65 Apy I BstE II Mae III 30 60 55 Ban I Mae I Sma I 50 45 25 3. 温度 DNA分子的不同构型对限制性内切酶的活性也有很大的影响。某些限制性核酸内切酶切割超螺旋的质粒DNA所需要的酶量要比消化线性的DNA量高出很多倍。 是影响限制酶活性的重要因素。商品化的限制酶一般都带有专用缓冲液。 5. 缓冲液 化学组成 MgCl2、NaCl/KCl：提供Mg2+和离子强度 Tris-HCl：维持pH 二硫苏糖醇（DTT）：保持酶稳定性 牛血清白蛋白BSA等：有助于酶的稳定 如果改变反应条件就会影响酶的专一性和切割效率，称为星号活性。 在低盐、高pH（8）时可识别和切割 GAATTA、AAATTC、GAGTTC等 GAATTC EcoR I： DNA重组 限制酶（物理）图谱绘制 突变分析（RFLP分析） 限制酶的部分酶切与完全酶切 * * 核酸内切酶分为单链DNA内切酶和双链DNA内切酶。能定点切割DNA双链的内切酶称为限制性内切酶。 限制：限制性内切酶将侵入细菌体内的外源DNA切成小片断。 修饰：细菌自身的DNA碱基被甲基化酶甲基化修饰所保护，不能被自身的限制性内切酶识别切割。 限制酶概念提出的背景： 20世纪30年代，微生物学家发现，微生物的噬菌体不能交叉感染，如E coli K株的噬菌体只能感染 E coli K株，不能感染其他株，反之亦然。这种现象称为“限制现象”。 1962年，W．Arber提出一个假设来解释上述现象。他认为这是细菌中有2种以上功能不同的酶，一 种是核内切酶，能识别并切断外来DNA分子的某些部位，使外来DNA失去活性，限制外来噬菌体的繁 殖，把这类酶称为限制性核酸内切酶。 * * I型限制性内切酶作用时需要ATP、Mg2+、SAM（５—腺苷甲硫氨酸）存在。 * 粘性末端的意义： ①连接便利 不同的DNA双链：只要粘性末端碱基互补就可以连接。这比连接两个平齐末端容易的多。 同一个DNA分子内连接：通过两个相同的粘性末端可以连接成环形分子。 ② 5’末端标记 凸出的5’末端可用DNA多核苷酸激酶进行32P标记。 凸出的3’端可以通过末端转移酶添加几个多聚核苷酸的尾巴（如AAA或TTT等）造成人工粘性末端。 ③ 补平成平齐末端 粘性末端可以用DNA聚合酶补平成平齐末端。 * 限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism，缩写RFLP)是发展最早的分子标记技术。RFLP技术的原理是检测DNA在限制性内切酶酶切后形成的特定DNA片段的大小。因此凡是可以引起酶切位点变异的突变如点突变（新产生和去除酶切位点）和一段DNA的重新组织（如插入和缺失造成酶切位点间的长度发生变化）等均可导致 RFLP的产生。 此技术及其从中发展出来的一些变型均包括以下基本步骤：DNA的提取、用限制性内切酶酶切DNA、用凝胶电泳分开DNA片段、把DNA片段转移到滤膜上、利用放射性标记的探针显示特定的DNA片段（通过Southern杂交）、分析结果。由于线粒体和叶绿体DNA较小，前三个步骤就完全可能检测出DNA片段的差异，所以往往不必要后面的几个步骤；对线粒体和叶绿体DNA进行的这种多态性差异检测在1980年之前就已出现，从理论上说，这种多态性也可称为RFLP。 限制性核酸内切酶是一类能够识别双链DNA分子