水稻抗稻瘟病基因Pi25、Pi56（t）、Pit和Pita的分子鉴定.docVIP

水稻抗稻瘟病基因Pi25、Pi56（t）、Pit和Pita的分子鉴定 　　摘要：根据抗病基因在抗病材料和感病材料中的SNP位点设计引物，通过PCR扩增或CAPS标记，对16份水稻材料中的4个抗病基因Pi25、Pi56（t）、Pit和Pita进行了鉴定。结果表明，9份水稻材料中携带Pi25，6份材料中携带Pita，1份材料中携带Pit（杂合型），无材料携带Pi56（t）。 　　关键词：稻瘟病；抗病基因；分子鉴定 　　中图分类号：S338 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2016）24-6604-04 　　DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.24.070 　　稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）引起的稻瘟病是一种世界性的稻作病害，在世界各个水稻生产国每年都有不同程度的发生[1]，每年因稻瘟病导致的生产损失约占总产量的10%～15%[2]。稻瘟菌小种具有高度的变异性，随着抗性基因的持续利用，病原菌群体遗传结构会不断发生变化，出现新的生理小种，从而导致小种专化抗性丧失，多数抗性品种在种植几年后会逐渐丧失抗病性[3]。因此，鉴定和发掘新的抗病基因是有效解决稻瘟病的新途径。 　　随着水稻品种稻瘟病抗性基因的不断鉴定，截至2014年，在不同的稻种资源中鉴定的稻瘟病主效抗病基因超过86个，微效基因（Quantitative trait loci，QTL）约350个[4，5]，分布于水稻的12条染色体。这些已鉴定的稻瘟病抗性基因绝大部分都是显性的，其中45%来源于粳稻，51%来源于籼稻，剩下4%来源于野生稻[6，7]。虽然通过发掘和鉴定抗病基因能够使水稻品种对稻瘟病的抗性不断增强，但由于稻瘟菌生理小种的高度变异性，所以有必要鉴定更多的稻瘟病抗性基因，并将这些抗病基因进行聚合。 　　现代分子生物学和分子标记技术的发展，使得研究者可以采用方便快捷的方法鉴定植物材料中是否存在抗病基因，如单核苷酸多态性（Single nucleotide polymorphisms，SNP）和酶切扩增多态性序列（Cleaved amplified polymorphic sequence，CAPS）。SNP的原理是两条相邻的寡核苷酸与模板退火，只有当其在接合处与模板完全匹配时才会在聚合酶的作用进行扩增，因而等位基因特异性寡核苷酸能够探察多态性位点碱基的性质[8]。CAPS原理在于不同的单核苷酸多态性序列对应着不同的限制性核酸内切酶（RE）识别和切割不同位点，稻瘟病抗病基因和感病基因之间SNP的差异导致RE切割得到不同大小的片段，由此可以判断水稻材料的抗或感病性[9]。 　　本研究选择16份部分携带有稻瘟病抗病基因Pi1、Pi2、Pi9、Pi24、Pi25的水稻材料，采用PCR方法或CAPS标记鉴定这些材料中是否还含有新的抗病基因Pi25、Pi56（t）、Pit、Pita，以便拓宽这些材料在稻瘟病抗病育种中的应用。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 　　试验材料为广西农业科学院提供的16份水稻材料，编号为505、506、507、508、509、510、511、512、513、514、515、516、517、518、谷梅2号、三黄占。已知510、511和512携带Pi1，513和514携带Pi2，505、509、517和518携带Pi9，谷梅2号携带Pi24、Pi25，其他材料抗病基因未知。 　　1.2 方法 　　1.2.1 引物设计 以文献[10]报道的编号为ta5和t256引物对检测Pit和Pit（a）基因。其中敏感引物对序列分别为ta5-SF/R和t256-SF/R，抗性引物对序列为ta5-RF/R和t256-RF/R。检测Pi56（t）的引物对分别为CRG4-1F/R、CRG4-3F/R，采用文献[9]报道的引物序列。检测Pi25的引物对为CAP1F/R，采用文献[11]报道的引物序列。引物序列信息见表1。 　　1.2.2 基因组DNA提取、PCR扩增及酶切 用CTAB法提取水稻基因组DNA，1%的琼脂糖凝胶检测水稻基因组DNA。CAP1、CRG4、t256、ta5 4对引物的PCR扩增体系均为：2 μL DNA模板、0.5 U Taq聚合酶、2 μL 10×PCR缓冲液、1.6 μL dNTPs（2.5 mmol/L）、0.5 μL正向引物（10 μmol/L）和0.5 μL反向引物（10 μmol/L），ddH2O补足至20 μL。PCR反应程序：94 ℃预?性3 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35个循环；72 ℃延伸5 min。CRG4、t256和ta5引物的PCR扩增产物直接取10 μL在1%琼脂糖凝胶上电泳检测。