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实验八 培养液及用液配制与消毒
实验八 培养液及用液配制与消毒 1、培养液种类(medium) 血清(FBS,FCS,CS,HS) 合成培养基 如:Eagle MEM、 DMEM、PRMI 1640、Ham F12等 无血清培养基(serum free medium) 2、培养用液 1)水与平衡盐溶液 培养用水 缓冲溶液 生理盐水 平衡盐溶液(BSS)如:PBS、 Hank’s、D-Hank’s液 2)其他培养用液 消化液:胰蛋白酶液、EDTA液 抗生素:青链霉素 pH调整液:HEPES液、NaHCO3 谷氨酰氨液 冻存液:用DMSO和培养液配制 1、滤器准备 清洗好过滤器,干燥,放入一张孔径0.22μm的微孔滤膜,用布包装好,15磅20 min进行高压灭菌处理。 在超净台内打开过滤器架好,胶管一端接入滤泵再插入待除菌的液体中,出口端胶管深入到已消毒好的瓶子中。 过滤后要检查滤膜是否完好无损。 2、配制步骤 1.准备超纯水或三蒸水。 2.加入合成培养基干粉,用磁力搅拌一定时间(2—4 h)使之充分溶解。 3.配制RPMll640培养基时应通入适量C02或加入6 mol/L盐酸调pH至6.0左右,这样才能充分溶解。 4.加入一定量NaHCO,调节pH至7.0左右。 5.加水至最终体积。 6.在超净台中对溶液进行滤过除菌,分装入250 mL或500 mL玻璃瓶中,用翻帽塞塞紧瓶口。 7.瓶口封好,4℃冰箱贮存。 四 注意事项 1.过滤时压力不要太大,以压力数字2为宜,否则细菌易滤过达不到除菌效果,或使滤膜破裂。 2. 分装时需根据使用量的多少分装于大小合适的瓶子中(分装量为使用3~5次用完为宜,并且每瓶只能装2/3体积的液体,过多时瓶子易爆或胶塞自喷)。 3. 滤器用毕立即刷洗,过蒸馏水,晾干收藏。 * 一、培养液及用液的种类 二、细胞培养用液的要求及成分 水:新鲜配置的三蒸水或去离子水 平衡盐溶液:无Ca2+、Mg2+的缓冲液 PBS:NaCl 8.0 g KCl 0.2 g Na2HPO4.H2O 1.56 g KH2PO4 0.20 加水至1000 ml 细胞生长条件 培养基: 培养基(培养液)是维持体外细胞生存和生长的溶液,分天然培养基和合成培养基。 1)天然培养基: 天然培养基有血清、血浆、和组织提取液(如鸡胚和牛胚浸液)。 优点:营养成分丰富,培养效果好 缺点:来源受限。 成分复杂,影响对某些实验产物的提取和实验结果的分析。 易发生支原体污染 细胞生长条件 2)合成培养基: 合成培养基是根据细胞生存所需物质的种类和数量,用人工方法模拟合成的。目前已设计出许多种培养基,如TC199、MEM、RPMI-1640、 DMEM等。 优点:标准化生产,组分和含量相对固定。成本低 。 缺点: 缺少某些成分,不能完全满足体外细胞生长需要。 细胞生长条件 人工合成培养基只能维持细胞生存,要想使细胞生长和繁殖,还需补充一定量的天然培养基(如血清)。 血清中含有: ①多种蛋白质(白蛋白、球蛋白、铁蛋白等) ; ②多种金属离子; ③激素; ④促贴附物质,如纤粘蛋白、冷析球蛋白、胶原等; ⑤各种生长因子; ⑥转移蛋白; ⑦不明成分。 细胞生长条件 一般说来,含5%小牛血清的培养基对大多数细胞可以维持细胞不死,但支持细胞生长一般需加10%血清. 血清质量好坏是实验成败的关键。 常用血清有胎牛血洁、新生牛血清、小牛血情、兔血清、马血清等,其中以胎牛血清质量最好。 优质血清的标准:透明,淡黄色,无沉淀物,无细菌、支原体、病毒污染。 血清的灭活(消除补体活性):56 ℃ ,30 分钟。 血清的消毒:过滤除菌。 细胞生长条件 消化液: 胰蛋白酶作用于与赖氨酸或精氨酸相连接的肽健,除去细胞间粘蛋白及糖蛋白,影响细胞骨架,从而使细胞分离。 胰蛋白酶是一种黄白色粉末,用无Ca2+、Mg2+的PBS缓冲液配制常用的胰蛋白酶液浓度是0.25% 。用滤器过滤除菌。 胰蛋白酶液消化时间:2-10分钟。 用含血清培养液终止其对细胞的消化作用。 细胞生长条件 抗菌素的使用: 在培养液配制后,培养液内常加适量抗菌素,以抑制可能存在的细
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