实验八 培养液及用液配制与消毒.ppt

实验八 培养液及用液配制与消毒 1、培养液种类（medium） 血清（FBS，FCS，CS，HS） 合成培养基 如:Eagle MEM、 DMEM、PRMI 1640、Ham F12等 无血清培养基（serum free medium） 2、培养用液 1）水与平衡盐溶液 培养用水 缓冲溶液 生理盐水 平衡盐溶液（BSS）如：PBS、 Hank’s、D-Hank’s液 2）其他培养用液 消化液：胰蛋白酶液、EDTA液 抗生素：青链霉素 pH调整液：HEPES液、NaHCO3 谷氨酰氨液 冻存液：用DMSO和培养液配制 1、滤器准备 清洗好过滤器，干燥，放入一张孔径0．22μm的微孔滤膜，用布包装好，15磅20 min进行高压灭菌处理。 在超净台内打开过滤器架好，胶管一端接入滤泵再插入待除菌的液体中，出口端胶管深入到已消毒好的瓶子中。 过滤后要检查滤膜是否完好无损。 2、配制步骤 1．准备超纯水或三蒸水。 2．加入合成培养基干粉，用磁力搅拌一定时间(2—4 h)使之充分溶解。 3．配制RPMll640培养基时应通入适量C02或加入6 mol／L盐酸调pH至6．0左右，这样才能充分溶解。 4．加入一定量NaHCO，调节pH至7．0左右。 5．加水至最终体积。 6．在超净台中对溶液进行滤过除菌，分装入250 mL或500 mL玻璃瓶中，用翻帽塞塞紧瓶口。 7．瓶口封好，4℃冰箱贮存。 四 注意事项 1．过滤时压力不要太大，以压力数字2为宜，否则细菌易滤过达不到除菌效果，或使滤膜破裂。 2. 分装时需根据使用量的多少分装于大小合适的瓶子中(分装量为使用3~5次用完为宜，并且每瓶只能装2／3体积的液体，过多时瓶子易爆或胶塞自喷)。 3. 滤器用毕立即刷洗，过蒸馏水，晾干收藏。 * 一、培养液及用液的种类 二、细胞培养用液的要求及成分 水：新鲜配置的三蒸水或去离子水 平衡盐溶液：无Ca2+、Mg2+的缓冲液 PBS：NaCl 8.0 g KCl 0.2 g Na2HPO4.H2O 1.56 g KH2PO4 0.20 加水至1000 ml 细胞生长条件 培养基： 培养基（培养液）是维持体外细胞生存和生长的溶液，分天然培养基和合成培养基。 1）天然培养基： 天然培养基有血清、血浆、和组织提取液（如鸡胚和牛胚浸液）。 优点：营养成分丰富，培养效果好 缺点：来源受限。 成分复杂，影响对某些实验产物的提取和实验结果的分析。 易发生支原体污染 细胞生长条件 2）合成培养基： 　　　　合成培养基是根据细胞生存所需物质的种类和数量，用人工方法模拟合成的。目前已设计出许多种培养基，如TC199、MEM、RPMI-1640、 DMEM等。 　　　　优点：标准化生产，组分和含量相对固定。成本低 。 　　　　缺点： 缺少某些成分，不能完全满足体外细胞生长需要。 细胞生长条件 　　　　人工合成培养基只能维持细胞生存，要想使细胞生长和繁殖，还需补充一定量的天然培养基（如血清）。 　　　　血清中含有： 　　　　①多种蛋白质（白蛋白、球蛋白、铁蛋白等） ； 　　　　②多种金属离子； 　　　　③激素； 　　　　④促贴附物质，如纤粘蛋白、冷析球蛋白、胶原等； 　　　　⑤各种生长因子； 　　　　⑥转移蛋白； 　　　　⑦不明成分。 细胞生长条件 一般说来，含5％小牛血清的培养基对大多数细胞可以维持细胞不死，但支持细胞生长一般需加10％血清． 血清质量好坏是实验成败的关键。 常用血清有胎牛血洁、新生牛血清、小牛血情、兔血清、马血清等，其中以胎牛血清质量最好。 优质血清的标准：透明，淡黄色，无沉淀物，无细菌、支原体、病毒污染。 血清的灭活（消除补体活性）：56 ℃ ，30 分钟。 血清的消毒：过滤除菌。 细胞生长条件 消化液： 胰蛋白酶作用于与赖氨酸或精氨酸相连接的肽健，除去细胞间粘蛋白及糖蛋白，影响细胞骨架，从而使细胞分离。 胰蛋白酶是一种黄白色粉末，用无Ca2+、Mg2+的PBS缓冲液配制常用的胰蛋白酶液浓度是0.25％ 。用滤器过滤除菌。 胰蛋白酶液消化时间：2-10分钟。 用含血清培养液终止其对细胞的消化作用。 细胞生长条件 抗菌素的使用： 在培养液配制后，培养液内常加适量抗菌素，以抑制可能存在的细