实验二 DNA的酶切、电泳结与Southern杂交.pptVIP

实验目的 学习并掌握DNA酶切、电泳技术 学习掌握Southern杂交的原理和技术 实验原理 限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异位点上，并切割双链DNA。它可分为三类： Ⅰ类和Ⅲ类酶在同一蛋白质分子中兼有切割和修饰（甲基化）作用且依赖于ATP的存在。Ⅰ类酶结合于识别位点并随机的切割识别位点不远处的DNA，而Ⅲ类酶在识别位点上切割DNA分子，然后从底物上解离。 Ⅱ类由两种酶组成： 一种为限制性内切核酸酶（限制酶）,它切割某一特异的核苷酸序列； 另一种为独立的甲基化酶，它修饰同一识别序列。 Ⅱ类中的限制性内切酶在分子克隆中得到了广泛应用，它们是重组DNA的基础。 Ⅱ类中的限制性内切酶在分子克隆中得到了广泛应用，它们是重组DNA的基础。 绝大多数Ⅱ类限制酶识别长度为4至6个核苷酸的回文对称特异核苷酸序列(如EcoRⅠ识别六个核苷酸序列：5- G↓AATTC-3)，有少数酶识别更长的序列或简并序列。 Ⅱ类酶切割位点在识别序列中，有的在对称轴处切割,产生平末端的DNA片段(如SmaⅠ：5-CCC↓GGG-3);有的切割位点在对称轴一侧，产生带有单链突出末端的DNA片段称粘性未端，如EcoRⅠ切割识别序列后产生两个互补的粘性末端。 5 5 GAATTC CTTAAG GAATTC CTTAAG EcoRI 5 G CTTAA p AATTC G 5 p 5 5 GAATTC CTTAAG GAATTC CTTAAG EcoRI 5 G CTTAA p AATTC G 5 p 5 5 AGCT TCGA Alu I 5 AG TC p CT GA 5 p AGCT TCGA 酶切后平末端 酶切后粘性末端 DNA纯度、缓冲液、温度条件及限制性内切酶本身都会影响限制性内切酶的活性。 大部分限制性内切酶不受RNA或单链DNA的影响。当微量的污染物进入限制性内切酶贮存液中时，会影响其进一步使用，因此在吸取限制性内切酶时，每次都要用新的吸管头。 如果采用两种限制性内切酶，必须要注意分别提供各自的最适盐浓度。若两者可用同一缓冲液,则可同时水解。若需要不同的盐浓度,则低盐浓度的限制性内切酶必须首先使用，随后调节盐浓度，再用高盐浓度的限制性内切酶水解。也可在第一个酶切反应完成后，用等体积酚/氯仿抽提，加0.1倍体积3mol/L NaAc和2倍体积无水乙醇，混匀后置-70℃低温冰箱30分钟，离心、干燥并重新溶于缓冲液后进行第二个酶切反应。 酶切过程中的注意事项 在酶切过程中，为了获得条带清晰的电泳图谱，一般DNA用量约为0.5-1μg。 限制性内切酶的酶解反应最适条件各不相同,各种酶有其相应的酶切缓冲液和最适反应温度(大多数为37℃)。 对质粒DNA酶切反应而言, 限制性内切酶用量可按标准体系1μg DNA加1单位酶,消化1-2小时。但要完全酶解则必须增加酶的用量,一般增加2-3倍,甚至更多,反应时间也要适当延长。 酶切过程中的注意事项 DNA限制性内切酶酶切图谱又称DNA的物理图谱，它由一系列位置确定的多种限制性内切酶酶切位点组成，以直线或环状图式表示。在DNA序列分析、基因组的功能图谱绘制、DNA的无性繁殖、基因文库的构建等工作中，建立限制性内切酶图谱都是不可缺少的环节，近年来发展起来的限制性片段长度多态性(RFLP)技术更是建立在它的基础之上。 技术应用 DNA限制性内切酶酶切图谱 目标DNA片段分析 基因工程中外源DNA与载体的连接 目标DNA片段分析 基因工程中外源DNA与载体的连接 DNA限制性内切酶酶切图谱 Southern杂交 建立酶切反应体系 适量DNA 2ul 10x限制性内切酶缓冲液 2ul 40 mmol/L spermidine 1ul 100 mmol/L DTT 限制性内切酶 2Ｕ/ug DNA 加ddH2O定容至20ul 注意：酶、缓冲液等需置于冰上；反应中酶应该是最后一个加入的试剂。 37摄氏度保温1小时 Southern杂交技术原理与流程 Southern印迹杂交（Southern blot）是1975年由英国人southern创建，是研究DNA图谱的基本技术，在遗传病诊断、DNA图谱分析及PCR产物分析等方面有重要价值。 基本原理：具有一定同源性的两条核酸单链在一定的条件下，可按碱基互补的原则形成双链，此杂交过程是高度特异的。由核酸分子的高度特异性及检测方法的灵敏性，综合凝胶电泳和核酸内切酶的分析结果，便可绘制出DNA分子的限制图谱。但为了进一步构建出DNA分子的遗传图，或进行目的基因序列的测定以满足基因克隆的特殊要求，还必需掌握DNA分子中基因编码区的大小和位置。这类数据资料均可应用Southern杂交技术获得。 Southern