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分子生物学实验常见问题分析及对策-20 质粒的提取常见问题与对策 Q1: 提质粒没有明显的沉淀，能说明是没有提出来吗？跑完电泳还是没有条带能证明质粒没提出来吗？A: 提质粒的时候没有明显的沉淀，也有可能是由于你加的乙醇量少或异丙醇量不足或质量有问题。或者质粒太少了难以用肉眼看出。跑完电泳还是没有条带也有可能是跑胶时配置胶出问题，或染色剂不够，或者你加的质粒量少。要具体情况再分析 Q2:质粒条带很暗而且通常只有一条带是什么问题？A:没有用试剂盒提取的话可能考虑技术问题。如果常做质粒的提取，且用的是试剂盒，还出现这种情况，就要从质粒本身着手考虑了：首先做个PCR鉴定一下，确保有质粒的情况下，很可能质粒是低拷贝的，如此就要用大量的细菌来提取质粒。一般的用可以用水煮法提(1ml菌液离心,沉淀加50μl DEPC 水,100度水煮3-4分钟,离心取上清夜,含有大量的质粒)用1-2μl作为模板跑PCR效果很好。 Q3: 用分光光度计测得的质粒浓度很高，但是跑出来的电泳却看不到条带，这是什么原因？A: 三种可能：1）可能EB有问题，应同时检查同一块胶上其它样品是否有条带。2）计算OD260/280比例，有可能为蛋白污染所致。3）稀释后上样的浓度过低。 Q4: 提质粒电泳显示应该几条带？哪种情况较好？A: 质粒在电泳时会出现三种情况的图谱：1）三条带，按照电泳泳动速度（快到慢）排列为：超螺旋、缺口闭环、开环。经常会出现。2）两条带，超螺旋/闭环/开环 任意两种。3）一条带，超螺旋。至于那种情况好，要看我们进一步实验的目的了。1）进行分子克隆的操作，构建载体。这随便那种情况都可以，不会影响你的后续实验。所以在这种情况下，没必要评比谁好谁不好。2）进行细胞转染。因为转染必须要超螺旋，所以它们的质量好坏顺序是： 3）、2）、1）。 Q5: 如何降低质粒变性超螺旋的含量？A: 理论上，用碱裂解法抽提质粒，变性超螺旋的出现是不可避免的。之所以大家没有非常在意，一是因为它的存在似乎对酶反应没有任何影响，二是因为它的含量并不一定高到被用电泳观察到。抽提使用相对过剩的溶液，在加入溶液 II 后，体系能在 1 分钟内变澄清，再快速加入溶液 III，这样基本上能将变性超螺旋的出现控制在电泳看不见的水平。 (变性超螺旋电泳时比正常超螺旋跑得快一点点。) Q6: 质粒大小如何在电泳中的鉴定？A: 1.从细菌中大量提取的质粒电泳时，不一定均出现三条带，有时会出现两条，甚至一条(一般是超螺旋的质粒)，这跟上样量也有些关系。出现不同的结果都是由抽提质粒时的操作手法造成的。如果严格按照操作步骤，超螺旋的质粒会较多。2.酶切将质粒线性化以后，才可以用marker判断大小。如果有三种构像，可以用中间那条带与marker比较判断大小。3.商品化的质粒估计应该大部分是超螺旋构像。4.酶切后线性化条带电泳时所处的位置就指示质粒的大小。 Q7:首次进行小量制备质粒时，有时会发现质粒ＤＮＡ不能被限制酶所切割是为什么？A: 这几乎总是由于从细菌沉淀或从核酸沉淀中去除所有上清液时注意得不够。大多数情况下，用酚：氯仿对溶液进行抽提可以去除小量备物中的杂质。如果总是依然存在，可用离心柱层析注纯化ＤＮＡ。 Q8: 大提质粒产量低的原因是什么？A: 大体积摇菌时，注意培养基最多只能占摇瓶体积的1/4，单纯地增加摇速是没有用的。另外，加溶液I裂解时，要注意充分裂解。你的溶液II加入后，溶液没有澄清，说明一是菌体没有裂解好，二是溶液II的酸碱度有问题或者其他原因。在溶液II没有完全澄清的情况下，加入溶液III, plasmid就会包裹在基因组的粘团之中，随沉渣一起被沉淀下来。不信你把沉渣再加入溶液II和III,会再提出一部分质粒出来。建议可使用Kit以提高质粒产量。 Q9: 小提质粒的产量很高，但大提的产量不高，如何注意大提质粒的手法和细节？A: 1. 溶液1，5ml；溶液2，10ml；溶液3，7.5ml2.加溶液2后，缓慢颠倒数次，见到蛋清样液体挂在离心管壁上，开离心管盖后，有拉丝现象。3.异丙醇后，烤沉淀的时间不宜太长，质粒烤得太干，一是有损失，二是难溶。4.加TE溶解质粒时，如果30分钟后还不溶，可能是TE中，质粒达到过饱和，补加适量的TE即可 Q10: 超过10K的质粒转化要注意什么问题？A: 选择高效转化效率的感受态细胞，DH5a可以做为较大质粒的宿主菌。 Q11:沉淀质粒DNA的方法有哪些？可以用什么代替无水乙醇？A: 用无水乙醇沉淀DNA，这是实验中最常用的沉淀DNA的方法。乙醇的优点是可以任意比和水相混溶，乙醇与核酸不会起任何化学反应，对DNA很安全，因此是理想的沉淀剂。一般实验中，是加2倍体积的无水乙醇与DNA相混合，其乙醇的最终