转印膜的简的单介绍.pptVIP

印迹试验中转印膜的简单介绍 Lola 2015.5.20 培训内容 以蛋白质印迹试验为例了解印迹试验的基本原理 转印膜在印迹试验中的作用 如何根据实验目的，选择转印膜 常见的印迹试验转印膜的优缺点 Western Blot 由来 印迹法（blotting）是指将样品转移到固相载体上，而后利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。 1975年，Southern将DNA转移到硝酸纤维素膜（NC膜）上，并利用DNA－RNA杂交检测特定的DNA片段，称为Southern印迹法。 而后人们用类似的方法，对RNA和蛋白质进行印迹分析，对RNA的印迹分析称为Northern印迹法，对单向电泳后的蛋白质分子的印迹分析称为Western印迹法，对双向电泳后蛋白质分子的印迹分析称为Eastern印迹法。 Western Blot 基本原理 印迹试验中转印膜的作用：转膜 膜与蛋白质结合的原理:静电结合和疏水键结合 转移膜的选择 膜的抗溶剂性能：印迹试验中需要经过很多次长时间的化学试剂清洗浸泡。 膜的润湿性：使用之前需要有机溶剂或缓冲溶液润湿。 膜孔径的大小：决定了能够拦截的蛋白质的大小。 膜与蛋白质的结合能力：单位面积与蛋白质的结合量。 膜的分辨率：对低浓度蛋白质的灵敏度。 封闭效果：降低背景。 可重复性：膜的机械强度和膜与蛋白质的结合强度。 显色方式：膜的抗溶剂性以及膜本身的物化性质有关，决定了印迹试验后期对印记的检测和显色方法的选择范围。 常见的印迹试验转印膜优缺点 常见的印迹试验转印膜优缺点——尼龙膜 尼龙膜机械强度高经历多次杂交、洗脱和标记后不易产生破损和变形，非常适合与核酸检测，而且超亲水性使其不需要润湿 常见的印迹试验转印膜优缺点——PVDF膜 PVDF膜机械强度高，耐高温和各种化学试剂，能够适用各种检查和显色手段，蛋白质结合能力强，是蛋白质印迹试验的最佳选择，尤其是蛋白质测序实验中，因为PVDF的抗溶剂性使其成为转印膜的唯一选择，缺点是价格比较贵。 常见的印迹试验转印膜优缺点-NC膜 NC膜是蛋白质印记最广泛使用的转移介质，对蛋白有很强的的结合能力，而且适用于各种显色方法，包括同位素、化学发光、常规显色和荧光显色，背景低，信噪比高。 NC膜很容易封闭，不需要特别严谨的清洗条件，而且转移到NC膜上的蛋白在合适条件下可以保存很长时间。 NC机械强度较差，不适合用于需要多次重复清洗的用途，而且其蛋白结合能力与纤维素纯度有关。 NC膜孔径的选择：0.45μm一般蛋白，0.2μm分子量小于20kD，0.1μm分子量小于7kD。 谢谢 欢迎大家提出问题讨论 western印迹试验中与膜有关的实验步骤有哪些？ 为什么要对膜进行封闭？ PVDF成为蛋白质测序实验里的唯一选择是因为什么？ 常见的三款转印膜最主要的应用领域分别是什么 尼龙膜最大的应用优势是什么？ * 凝胶电泳：根据蛋白质在凝胶里的泳动速率不同，将其分离开来。 转膜：用毛细管印迹法或者电泳印迹法将凝胶里的蛋白质转移到膜上，通过静电力和疏水键将蛋白质与膜表面的膜孔结合起来。 封闭：用封闭液将膜表面未与蛋白质结合的孔封闭，避免在一抗与蛋白质杂交的过程中与膜孔发生非特异性结合，造成对靶蛋白的影响。 一抗杂交：用与待研究的蛋白质具有特异性的抗体进行杂交，这样就可以通过一抗确定待研究的蛋白质的位置。 二抗杂交：用与一抗具有特异性的二抗进行杂交，标记一抗的位置。 显色：二抗一般是酶蛋白，用与这种酶蛋白发生催化反应的底物与之反应，显色，标记二抗的位置，进而标记一抗、待研究蛋白质的位置。 成像 电泳印迹法（湿转和半湿转） 毛细管印迹法 NC膜 尼龙膜 PVDF膜 灵敏度和分辨率 高 高 高 背景 低 较高 低 材料质地 干的NC膜易脆 软而结实 机械强度高 溶剂耐受性 差 较差 好 操作方便 缓冲溶液润湿，避免气泡 天然亲水性 100%的甲醇润湿 蛋白结合能力 80-110μg/cm2 400μg/cm2 125-200μg/cm2 检测方式 常规染色，可用放射性和非放射性检测 不能用阴离子染料，受限制 常规染色，较于NC膜可用考马斯亮蓝染色，ECL检测和快速免疫检测 适用范围 0.45μm一般蛋白 0.2μm分子量小于20kD 0.1μm分子量小于7kD 低浓度小分子蛋白，主要用在核酸检测 糖蛋白检测和蛋白质测序 价格 价格较便宜 便宜 较贵 灵敏度高 分辨率高：1-1000ng/lane 抗溶剂性好——多种显色剂 蛋白结合量高 *