纤维素酶活力的测定实验报告.doc

生物化学实验报告 题目：纤维素酶活力的测定 -----3、5—二硝基水杨酸法 姓名：余振洋 学号：200900140156 系年级：09级生科3班 同组者：张刚刚 时间：2011/4/22 一、【实验目的】 学习和掌握3、5—二硝基水杨酸（DNS）法测定纤维素酶活力的原理和方法，了解纤维素酶的作用特性。 二、【试验原理】 纤维素酶水解纤维素，产生纤维二糖、葡萄糖等还原糖，能将3、5-二销基水杨酸中销基还原成橙黄色的氨基化合物,在550nm波长处有最大光吸收，在一定范围内还原糖的量与反应液的颜色强度呈比例关系，利用比色法测定其还原糖生成的量就可测定纤维素酶的活力。 酶活力也称为酶活性，是指酶催化一定化学反应的能力。酶活力的大小可用在一定条件下，酶催化某一化学反应的速度来表示，酶催化反应速度愈大，酶活力愈高，反之活力愈低。测定酶活力实际就是测定酶促反应的速度。酶促反应速度可用单位时间内、单位体积中底物的减少量或产物的增加量来表示。在一般的酶促反应体系中，底物往往是过量的，测定初速度时，底物减少量占总量的极少部分，不易准确检测，而产物则是从无到有，只要测定方法灵敏，就可准确测定。因此一般以测定产物的增量来表示酶促反应速度较为合适。N×OD值对应的葡萄糖量　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 　纤维素酶活力单位＝—————————————— 30×L N——酶液的稀释倍数 30——糖化所用时间 L——反应酶液毫升数 三、【试验器材】 比色管10支，5ml移液管，移液枪，500ml大烧杯，水浴锅，电炉，搅拌振荡器，722 型或其他型号的可见分光光度计。 四、【实验试剂】 酶液：将0.05g酶溶解定容至50ml，从中取出1ml再定容至100ml，待测（用 PH4.5乙酸—乙酸钠缓冲溶液配制）。 2．0.1mol/L PH4.5的乙酸-乙酸钠缓冲溶液。 3．3、5—二硝基水杨酸显色液：称取10克3、5-二硝基水杨酸，溶入蒸馏水中，加入20克分析纯氢氧化钠，200克酒石酸钾钠，加水500毫升，升温溶解后，加入重蒸酚2克，无水亚硫酸钠0.5克。加热搅拌，待全溶后冷却，定容至1000ml。存于棕色瓶中，放置一周后使用。 4．0.5%羧甲基纤维素钠（CMC）水溶液，溶解后成胶状液，静置过夜。使用前摇匀。 5．标准葡萄糖溶液：称取干燥至恒重的葡萄糖100毫克，溶解后定容至100毫升，此溶液含葡萄糖1.00mg/ml。 五、【实验操作】 1．标准曲线的绘制：取6支比色管，分别加入葡萄糖0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 ml，再分别加入去离子水稀释至1ml，然后分别加入3、5—二硝基水杨酸显色剂3ml，在沸水浴中煮沸显色10min。冷却后定容至25ml，在550nm下测OD值。以光密度为纵坐标，以葡萄糖微克数为横坐标，绘出标准曲线。 2．空白管：取1ml酶液，沸水浴5分钟，冷却后加3ml0.5%CMC。 3．样品管：取三支比色管，分别加入3ml 0.5%CMC和1ml酶液，混匀，与空白管同时放入50℃水浴锅中水浴30min。到时间后，将比色管取出，再沸水浴10min，使酶失活，得糖化液。冷却后加入3ml 3、5-二硝基水杨酸显色液，再沸水浴10min。冷却后定容至25ml，混匀，与标准曲线同时在550nm下测OD值。 4．根据所做的图计算1g固体酶的活力。 六、【注意事项】 1．分光光度计在使用前应进行预热30min，使其发光稳定，且在无样品放置时，使试样室盖打开，以保护光电管。 2．测定时，调零用的1号管液一定要在相应的各管液测定完成后，方可从比色杯中弃掉。 3．用移液管或加液器加各试剂时，不能将移液管或取液枪头混用。 4．使用比色管时要将其擦拭干净，应用吸水纸吸去比色管表面溶液，用擦镜纸擦拭，以避免对比色管光滑面造成磨损。 5．在标准曲线制作时，应从低浓度到高浓度以此测量，因为低浓度的残留液对高浓度待测液的测定不会有太大影响，所以可不用润洗比色管，但若有高浓度到低浓测定，则需要对比色管进行润洗，以消除误差，因为高浓度残留液会对低浓度的溶液浓度造成很大影 七、【实验结果】 表一 葡萄糖标准曲线制作 管号 1 2 3 4 5 6 葡萄糖标(ml) 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 蒸馏水(ml) 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0 定容后总体积(ml) 25 25 25 25 25 25 光密度OD550nm 0.000 0.104 0.215 0.335 0.440 0.544 表二 纤维素酶光密度的测定 管号 空白管 样品管1 样品管2 样品管3 酶液(ml) 1.0 1.0