实验一,半定量RT-接PCR检测切割穹窿海马伞大鼠海马内.docVIP

南通大学硕士学位论文 实验一： 半定量RT-PCR检测切割穹窿海马伞大鼠海马内Brn-4 mRNA的表达变化 PAGE  PAGE - 19 - 实验一、 半定量RT-PCR检测切割穹窿海马伞大鼠海马内 Brn-4 mRNA的表达变化 本实验应用立体定位技术切割大鼠穹窿海马伞，取切割后1、3、7、14、21和28d海马组织和正常海马组织，制备提取液，然后应用半定量RT-PCR技术检测Brn-4 mRNA的表达，与正常海马组织比较，观察切割后各时相点海马组织中Brn-4 mRNA的表达变化。 材料和方法 1 实验材料 1.1实验动物： 健康成年SD大鼠，体重220~250g，雌雄不拘，由南通大学实验动物中心提供。 1.2试剂及溶液的配制： Trizol Reagent（BBI公司） DEPC（SIGMA公司） 逆转录试剂盒（MBI公司） Taq DNA polymerase（MBI公司） dNTP mix（MBI公司） DL-2000 DNA Maker（TAKARA公司） 琼脂糖（Pharmacia公司） 溴化乙锭(SIGMA公司) Chlorpent复合麻醉剂：水合氯醛4.25g，MgSO4 2.12g，戊巴比妥钠886mg，无水乙醇14.25ml，丙二醇33.8ml，加ddH2O至100ml。 （10）DEPC水：1000 ml双蒸水中加入DEPC 1ml，充分振荡，37℃孵育过夜，高压灭菌20 min，4℃保存备用。 （11） 5×TBE：Tris 54g，硼酸27.5g，EDTA 4.65g，加ddH2O至1000ml。使用时1:10稀释为0.5×TBE工作液。 （12）6×上样缓冲液：溴酚蓝0.25g溶于30%甘油100ml，分装小管，4℃储存。 （13）琼脂糖凝胶：根据待测DNA分子大小，选择适当浓度的琼脂糖浓度，用0.5×TBE缓冲液配置。 （14）EB染液(10mg/ml)：溴化乙锭1.0g，加ddH2O至100ml，4℃避光保存。 （15）5×甲醛凝胶电泳缓冲液：取20.6g丙磺酸溶于800ml DEPC处理的50mmol/L的乙酸钠溶液中，用氢氧化钠调pH至7.0，加10ml DEPC处理的0.5mol/L EDTA（pH8.0），最后加DEPC处理水至溶液总体积为1L。 （16）甲醛凝胶上样缓冲液：甲酰胺0.75ml，甲醛0.24ml，5×甲醛凝胶加样缓冲液0.3ml，甘油0.15ml，溴酚蓝0.05ml，置-20℃保存。 1.3实验仪器： 恒温水浴锅 (上海华联环境试验设备公司) 低温冷冻离心机 (德国Beckman公司) PCR仪 (MJ Research公司) DYY—10型（ECP3000）三恒电泳仪（北京市六一仪器厂） 捷达801系列形态学分析系统（江苏省捷达科技发展有限公司） 蛋白核酸测定仪（Eppendorf公司） 立体定位仪（上海江湾Ⅰ型C） 2 ???验方法 2.1实验动物分组 取SD大鼠42只，随机分成7组，设其中1组为正常对照组，其余6组分别为穹窿海马伞切割手术后1、3、7、14、21和28d组，每组6只。 2.2切割双侧穹窿海马伞 取220~250g SD大鼠，腹腔注射复合麻醉剂Chlorpent 0.2ml/100g。动物麻醉后，固定于立体定位仪上，颅顶部剪毛，碘酒和酒精消毒后，无菌条件下切开皮肤，分离颅骨外骨膜，显露前囟，记录前囟A（矢状轴）、L（冠状轴）、V（垂直轴）的坐标，参照Paxinos图谱确定双侧穹窿海马伞的切割范围，先在颅骨上确定右侧两点即①A1=A－1.4、L1＝L－1和②A2＝A－1.4、L2＝L－4；左侧两点即③A3=A－1.4 、L3＝L＋1和④A4＝A－1.4、L4＝L＋4，每点各钻一小孔，用刀片将右侧①和②、左侧③和④点间颅骨划开一条骨缝，将针刀插入脑内至切割深度即V1－2,3－4＝V+5.4，来回切割3次，退出针刀，待无颅内出血后用骨蜡封闭骨缝，缝合皮肤，肌注青霉素，按性别分笼饲养。 2.3海马总RNA的提取 将正常组及手术后各组大鼠用Chlorpent复合麻醉剂腹腔注射麻醉，无菌条件下剥去颅骨和硬脑膜，再去除大脑皮质和胼胝体，暴露两侧海马，证实两侧穹窿海马伞被切断后，取出两侧海马组织（约50mg/只）。 将取出的海马置2ml匀浆器中，加入1ml Trizol试剂，置冰上充分匀浆，室温置5min，转入1.5ml离心管； 加入200μl氯仿，剧烈震荡混匀30sec； 室温12000rpm离心5min； 转移上清到1.5ml离心管中，加入500μl异丙醇，室温放置5min； 室温12000rpm离心5min，小心移去上清； 加700μl 70%乙醇洗涤两次，12000rpm离心2min，弃上清。 室温干燥使乙醇完全挥发，沉淀用50μl