小麦抗旱似基因TANAC69的重组分子的构建及筛选鉴定.docxVIP

小麦抗旱基因TANAC69的重组分子的构建及筛选鉴定1，获取目的基因(试剂盒法)（TRIZOL是一种新型总RNA抽提试剂，可以直接从细胞或组织中提取总RNA，TRIZOL在破碎和溶解细胞时能保持RNA的完整性）样品处理：取?50-100mg?组织（新鲜或?-70?℃?及液氮中保存的组织均可）置于1.5ml?离心管中，加入?1ml?Trizol?充分匀浆，室温静置5min?。?（2）加入?0.2ml?氯仿，振荡?15s，静置?2min?。?（3）4℃?离心，?12000g×15min?，取上清。（氯仿抽提蛋白，异丙醇沉淀RNA，乙醇洗涤）?（4） 加入?0.5ml?异丙醇，将管中液体轻轻混匀，室温静置?10min?。?（5）4℃?离心，?12000g×10min?，弃上清。?（6）加入?1ml?75%?乙醇，轻轻洗涤沉淀。4℃ ，7500g×5min?，弃上清。?（7）让沉淀的RNA在室温下自然干燥；?（8）用Rnase-free?water?溶解RNA沉淀。（不含水的RNA酶溶解RNA沉淀）2，设计引物（长度一般为16-30bp，最佳为20-24bp，两个引物间不应发生互补避免形成引物二聚体）目标序列中酶的识别位点，(用DNMAN找出目标序列中的酶的识别位点)AluI, AlwI, BssHII, CfoI, EcoRI, HaeIII, HhaI， HpaII，MboI, NarI， NcoI， NheI， PstI RsaI SalI, Sau3A, SphI, StuI, TaqI, HindIII AAGCTT BamHIGGATCC（在引物的5’端添加限制性内切酶的识别位点及保护碱基方便克隆）（先找出序列中的启动子ATG和终止子TAG）（特定的酶有特定的保护碱基） Up 5’-CCC AAGCTT ATG CAG TAG CCA TCT-3’（CCC为保护碱基）（ATG启动子）（上游引物） Down 5’-CGC GGATCC CTA CAC CAA GAA TTC-3’（CGC为保护碱基）（TAG为终止子） （下游引物）（在进行PCR时需要确定具体参数，其中退火温度对扩增影响最大，而退火温度取决于引物的TM值，所以要确定ＴＭ值，退火温度掌握不好会发生非特异性结合，降低PCR产物的对模板的忠实程度） 1 gcagcatttt tatgcagtag ccatcttctc ctcctcctcc ccccgccttc cagctagcca 61 cctagctcac tatcacatca tccagcagcc cacaccaact catattgatt ccgttcccac 121 ctgctcgcca tcgccagcca tgccaatggg cagcagcgcc gccatgcccg ccctccctcc181 cggcttccgg ttccacccca ccgacgagga gctcatcgtc cactacctcc gcaggcaggc241 cgcgtccatg cccagccccg tgcccatcat cgccgaggtc aacatctaca agtgcaaccc 301 atgggacctc cccggcaaag ctttgttcgg ggagaatgag tggtacttct tcagcccccg361 ggatcgcaag taccccaacg gcgcgcgccc gaaccgcgcc gccgggtccg gctactggaa421 ggccaccggc accgacaagg ccatcctgtc cacgccggcc aacgagagca tcggggtcaa481 gaaggcgctc gtgttctaca ggggcaagcc gcccaagggc gtcaagaccg actggatcat541 gcacgagtac cgcctcaccg cagccgacaa ccggaccacc aagcgcagag gatcctccat601 gaggctggat gactgggtgc tgtgtaggat ccacaagaag tgcggcaact tgcccaactt661 ctcctcctct gaccaggaac aggagcatga gcaggagagc tccaccgtgg aggactcgca 721 gaacaaccac accgtgtcgt cgcccaagtc cgaggccttc gacggcgacg gcgacgacca781 cctccagttg cagcagttcc gccccatggc gatcgccaag tcgtgctccc tcaccgacct841 gctcaacacc gtcgactacg ccgcgctctc gc