枸杞紫黄质脱环氧化酶（LcVDE）基因的克隆和分析.PDFVIP

中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１４，３４（１）：２１２７ ＤＯＩ：１０．１３５２３／ｊ．ｃｂ 枸杞紫黄质脱环氧化酶（ＬｃＶＤＥ） 基因的克隆和分析 １ １ １ １ １ １ ２，３ １ 张旭强 　季　静 　王　罡 　钟　影 　刁进进 　关春峰 　吴　疆 　金　超 （１天津大学环境科学与工程学院　天津　３０００７２　２天津大学化工学院　天津　３０００７２　３天津农学院农学系　天津　３００３８４） 摘要　目的：克隆枸杞 ＶＤＥ基因的全长ｃＤＮＡ，通过对基因序列的生物信息学分析预测表达产物 的结构特征和功能位点并验证其功能，为研究枸杞紫黄质循环的作用机理打下基础。方法：利用 ｃＤＮＡ末端快速扩增和ＲＴＰＣＲ方法克隆枸杞ＶＤＥ基因全长ｃＤＮＡ序列，生物软件分析ＶＤＥ的生 物学信息。构建ＶＤＥ基因的原核表达载体ｐＥＴＶＤＥ，转化大肠后用ＩＰＴＧ诱导ＶＤＥ过量表达；并 构建体外反应体系对ＶＤＥ表达蛋白酶功能进行验证。结果：ＬｃＶＤＥ基因的ＯＲＦ长１４１３ｂｐ，编码 的蛋白由４７０个氨基酸组成，分子量为５３．６１ｋＤａ，等电点为５．７７。ＳＤＳＰＡＧＥ电泳结果表明，枸 杞 ＶＤＥ基因在大肠杆菌中得到了过量表达。克隆基因表达蛋白进行紫黄质的脱环氧化反应，吸 收光谱和ＨＰＬＣ的分析结果表明，表达蛋白催化了紫黄质的脱环氧化反应。结论：克隆得到的 ＶＤＥ基因编码的蛋白具有紫黄质脱环氧化酶的的功能与活性。 关键词　枸杞　紫黄质　紫黄质脱环氧化酶（ＶＤＥ） 中图分类号　Ｑ８１４ 　　强光环境下，叶片吸收的过剩的光能便会对使植 统ＩＩ过剩光能，保护叶绿素、反应中心和天线色素蛋白 物组织发生光抑制或光氧化，而植物体内存在多种途 ［４］ 复合体等免遭破坏 。另一方面，通过猝灭单线态的 径防止光损伤，主要有植物生理生化光保护机制和形 １ ３ 氧（Ｏ ）和三线态叶绿素（Ｃｈｌ ），减少活性氧的产   ２ 态结构上的保护机制。生理生化光保护机制主要有荧 ［５］ 生，起到对细胞膜的保护作用 。 光猝灭与激发能耗散、光呼吸作用、Ｍｅｈｌｅｒ反应、叶绿 　　ＶＤＥ是紫黄质循环中的关键酶，其催化紫黄质一 体类囊体膜蛋白的磷酸化作用、ＱＢ蛋白复合体内Ｄ１ 端脱环氧化生成双键形成中间产物花药黄质，花药黄 蛋白的降解与重新合成、硝酸还原代谢等。形态结构 ［６］ 质进一步脱环氧化生成玉米黄质。Ｈａｇｅｒ 首次报道了 上的保护机制以减少到达光合器官的辐射能为目的， ＶＤＥ酶，属于水溶性蛋白，定位于类囊体膜内侧。在强 ［１２］ 如叶方向和叶位角的改变、盐化硬皮的生成等 。 光照下，反应迅速，能在１０～３０ｍｉｎ内将Ｖ转化为Ａ和 　　紫黄质循环（图１）在植物的荧光猝灭与激发能耗 ［７］ Ｚ 。 散机制中有重要作用。紫黄质循环，主要由紫黄