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第三章细胞生物学研究方法 METHODS AND TECHNIQUES 第二版和第三版P49 从整个生命科学的发展趋势看细胞生物学研究 分子水平 细胞水平 结构功能 细胞生命活动 分析 综合 整个生命科学的发展最终是要解释生命的活动规律，而生命的活动规律要到细胞中去寻找。 而要了解细胞的活动规律，我们要在分子水平细胞内各种生物分子的代谢规律，这就需要研究细胞内的各种组分 另外我们还要了解细胞的结构和功能， 2 由于课时所限，我们不可能所有的方法都详细讲解。 3 Main point 第一节 显微技术(细胞的形态学观察技术） 一、光学显微镜 二、电子显微镜 三、显微操作技术 第二节 细胞分离技术 第三节 生物化学与分子生物学技术 第四节 细胞培养与细胞杂交 本章重点： 1. 掌握细胞形态结构的观察方法（主要是光学显微镜、电子显微镜）； 2. 掌握细胞培养、细胞工程的基本技术； 3. 了解细胞组分的分析方法。 第一节 显微技术 工具是人类器官的延伸。显微镜300多年的改进是从器具和观察对象两方面着手提高放大倍数和增加分辨细微结构的能力。 在器具上，包括选择投射于物体上的波束的性质及为便于观察而不断改善操纵装置； 在观察对象上，则是如何突显待观察的部分。 波束有光波和电磁波， 光学显微镜：以可见光（或紫外线）为光源。 电子显微镜：以电子束为光源。 第一节 显微技术 —、光学显微镜(The Light Microscopy) （一）普通光学显微镜 骆驼刺根尖染色体 对二氯苯饱和溶液处理 9 光学显微镜是如何作到这一点的? （一）普通光学显微镜 可变光阑 管镜 目镜 2. 原理：经物镜形成倒立实像，经目镜进一步放大成像。 放大率（magnification）:最终成像的大小与原物体大小的比值; 分辨率/力（Resolution）：分辨或区分两质点间最小距离。 （一）普通光学显微镜 3. 分辨力：指分辨物体最小间隔的能力。 D=0.61λ/Nsinθ 其中λ为入射光线波长； N=介质折射率； Nsin θ＝镜口率 (低倍镜0.28，高倍 镜0.65，油镜1.25. 2 θ =镜口角(样品对物镜镜口的张角); 通常2θ最大值可达140度， 空气N＝1，D约0.3um。 油镜N＝1.5，此时分辨率D可达0.2um， 思考：如何提高显微镜的分辨能力？ 12 表一、几种介质的折射率 （二）相差显微镜 Figure 3-2. Interference between light waves. When two light waves combine in phase, the amplitude of the resultant wave is larger and the brightness is increased. Two light waves that are out of phase partially cancel each other and produce a wave whose amplitude, and therefore brightness, is decreased. A+/B+ 相位板（annular phaseplate）在物镜中加了涂有氟化镁，可将直射光或衍射光的相位推迟1/4λ。分为两种： 1.A+相板：将直射光推迟1/4λ，两组光波合轴后光波相加，振幅加大，标本结构比周围介质更加变亮，形成亮反差（或称负反差）。 2.B+相板：将衍射光推迟1/4λ，两组光线合轴后光波相减，振幅变小，形成暗反差（或称正反差），结构比周围介质更加变暗。 （二）相差显微镜 基本原理： 利用光的衍射和干涉现象，把光程差变成振幅差(即明暗)。从而提高各种结构间的对比度，明者更明，暗者更暗，立体感增强，使各种结构变得清晰可见。故样品不需染色，适合观察活细胞。 （二）相差显微镜 与普通光学显微镜相比有两个特殊之处： 相位板 环形光阑（位于光源与聚光器之间，作用是使透过聚光器的光线形成空心光锥，焦聚到标本上。 使用时，环状光阑的中心与物镜光轴要完全在一直线上 18 环状光阑是由大小不同的环状孔形成的光阑，它们的直径和孔宽是与不同的物镜相匹配的。其作用是将直射光所形成的像从一些衍射旁像中分出来。 用途：可观察未经染色的玻片标本，活细胞动态，有时也可用于观察缺少反差的染色样品。 （三）微分干涉差显微镜 （DIC） 原理：利用两组平面偏振光的干涉。光线经棱镜折射后分成两束，分裂出来