第1章-2 核酸的性质与研究方法(郭蔼光主编配套课件).ppt

核酸分子中的嘌呤和嘧啶碱基中含有共轭双键体系，因而具有特殊的紫外吸收光谱，其最大吸收峰位于260nm处，而蛋白质最大吸收峰280nm。利用这一性质可定量测定核酸的含量或鉴定核酸的纯度。 通常从A260/A280的比值既可判断样品的纯度 核酸 ：OD260 蛋白 ：OD280 酚类：OD320 ①DNA： ≈1.8 纯品 OD260/OD280 ＞1.8 RNA 污染 ＜1.8 pro 污染 ②RNA： OD260/OD280 ≈2.0 纯品 影响DNA的Tm值的因素： DNA的均一性 DNA分子中碱基组成的均一性：只含有一种碱基对的多核苷酸片段，比天然DNA的Tm值范围窄。因它在变性时的氢链断裂几乎可“齐同”进行，故所要求的变性温度更趋于一致。 待测样品DNA的组成是否均一：如样品中只含有一种DNA，其Tm值范围较窄， 若混杂有其它来源的DNA，则Tm值范围较宽。原因也与DNA的碱基组成有关。 不同生物中（G+C）含量: 20% - 80% A = T,G≡C,破坏G-C间氢键需比A-T氢键付出更多的能量。DNA中(G+C)含量高能增强结构的稳定性， 所以,DNA分子中的(G+C)的含量越高，Tm值越高。 当DNA溶于0.2mol/L NaCl： (G+C)%=(Tm-69.3) ×2.44 介质离子强度 介质离子强度低，Tm值低； 介质离子强度高，Tm值高。 DNA制品应保存于介质离子浓度高的溶液。 DNA制品通常保存于1.0mol/L NaCl溶液中。 完 * 主讲老师：白生文 bsw4588384@163.com 2011-2012学年第一学期 核 酸 §1.3 核酸的理化性质 §1.4 核酸的分离纯化、测定及研究方法 【主要内容】： 一.物理性质 1.性状：RNA及其组分核苷酸、核苷、嘌呤碱、嘧啶碱的纯品都呈白色的粉末或结晶；DNA则为疏松的石棉一样的纤维状固体。 2.溶解性：RNA和DNA都是极性的化合物，一般说来，这些化合物都微溶于水，不溶于乙醇、乙醚、氯仿等有机溶剂。它们的钠盐易溶于水。 DNA和RNA在生物细胞内都与蛋白质结合成核蛋白,DNA核蛋白与RNA核蛋白的溶解度受溶液的盐浓度的影响而不同。 DNA蛋白在低浓度的盐溶液中随盐浓度的增加而增加，在1mol/L的NaCl溶液中溶解度比纯水高2倍，在0.14mol/L的NaCl溶液中溶解度最低，仅为水的1%，几乎不溶解；而RNA蛋白在盐溶液中其溶解度受盐浓度的影响较小，在0.14mol/L的NaCl溶解度较大。因此，在核酸的提取中，常用此法将两种核蛋白分开，然后用蛋白质变性剂去除蛋白质。 3.粘性：核酸的水溶液粘度很大，粘度DNA大于RNA。核酸变性后，粘度下降。 1.3 核酸的理化性质及其应用 碱解 二.核酸可被酸、碱或酶水解，DNA比RNA稀碱稳定。 三.核酸的两性电离与等电点 核酸的磷酸基具有酸性，碱基具有碱性，因此，核酸具有两性电离的性质。但核酸中磷酸基的酸性大于碱基的碱性，故其等电点偏酸性。DNA的pI约为4～5，RNA的pI约为2.0～2.5，在pH7～8电泳时泳向正极。 两性电离的性质 四.核酸紫外吸收 所以,样品中如含有蛋白质及苯酚等杂质，此比值明显降低。 核酸的紫外吸收 对于纯的样品，只要读出A260即可算出含量： 1 OD相当于50ug/毫升双链DNA; 或40ug/毫升单链DNA/RNA; 或20ug /毫升寡核苷酸. 对于不纯的样品，可以琼脂糖凝胶电泳分离出带后，经啡啶溴红染色而粗略估计其含量 五.DNA的变性、复性与分子杂交 （一） DNA变性(denaturation) 1.DNA变性的概念：指DNA分子中的双螺旋结构解链为无规则线性结构的现象。 2.DNA变性的本质：维持双螺旋稳定性的氢键断裂，碱基间的堆积力遭到破坏，但不涉及到其一级结构的改变。 3.导致DNA变性的因素：凡能破坏双螺旋稳定性的因素，如加热、极端的pH、有机试剂甲醇、乙醇、尿素及甲酰胺等，均可引起核酸分子变性 P26-27 4.变性DNA的特征： （1）溶液粘度降低：DNA双螺旋是紧密的刚性结构，变性后转化成柔软而松散的无规则单股线性结构，因此粘度明显下降; （2）旋光性发生变化：变性后整个DNA分子的对称性及分子构型改变，使DNA溶液的旋光性发生变化; （3）紫外吸收增强; （4）密度上升. 增色效应(hyperchromic effect)