11.第六章 扫描电镜样品制备技术.pptVIP

* * 第六章 扫描电镜生物样品 制备技术 扫描电镜对生物医学观察样品的要求 扫描电镜是以电子束在样品表面扫描激发出的二次电子作为成像第一信号，最后转换成样品形貌图像的，所以它对观察的样品有特殊的要求，适合扫描电镜观察的样品必须具备以下条件： 1、在形态结构上应接近生活状态。生物组织内含有大量的水分，因此在观察之前，即要想办法去除水分，又不能改变了它的原始形貌。 2、表面应具有很好的导电性能。生物样品是由低原子序数的物质组成的，除在含水时能导电外，当干燥后基本是一个绝缘体，这就要想办法进行导电处理，使它能够导电。 3、应能产生丰富的二次电子。可以导电的物质很多，并非都能用作扫描电镜生物样品的导电处理。目前常用于扫描生物样品制备导电处理的物质有黄金、铂金及铂—钯合金和铂—铱合金。只有这些金属对生物样品导电处理后，才能产生丰富的二次电。 4、样品能耐高真空和耐电子束的轰击。如果样品制作的不合乎要求，当电子束在表面扫描时，会产生电荷的积累，造成观察图像亮的地方很亮，黑的部位很黑，样品的结构细节看不清楚，严重时会造成样品的损伤。 生物医学样品为了满足扫描电镜的观察要求，必须严格按照制作程序制作，含水的和不含水的样品制作方法是不同。 第一节 含水生物扫描样品制备的 基本步骤与方法 在生物扫描样品制备技术中，除了一些含水量很少（如植物的花粉，干燥的木材），外壳很坚硬，自然干燥不会造成形貌变化的材料（如骨骼、甲壳虫等）外，所有含水生物材料都要按如下步骤制作样品。 1、取材与清洗 扫描生物样品对取材的要求有很多方面同超薄切片，但也有不同之处。 1）、取材的方法 动物和植物组织的取材：方法与超薄切片的取材基本相同，只是因为扫描电镜主要是观察组织的游离表面形态结构，因此在取材时一定要保护好所需要的游离表面的部位，不能造成任何损伤；另外所取样品块可稍大一些，一般观察面大小可在长X宽大约为3X5毫米（可根据样品的性质变化取材的大小）。 离体培养的细胞取材：可在接种时把处理好的盖玻片放在培养瓶内，让细胞长在盖片上，把带有细胞的盖片直接进行制样处理。 细菌的取材：平板和斜面培养的，可用牙签取菌落涂到干净的盖片上，进行制样。 悬液培养的细胞或细菌要离心收集细胞或细菌，然后再进行制样。 2）、 取材的注意事项 （1）、所取材料块的大小要适中，在便于操作的情况下，应尽量取得小一些。因为样品块过大制样时虽然好操作，但各步骤处理的时间要加长；如果样品块取得太小，不便于操作。 （2）、取材的部位一定要准确。在取材的过程中一定要尽量去掉不需要的组织。 （3）、需要取对比样品时，实验组和对照组一定要取相同一致的部位，这样才有对比意义。 （4）、对某些时间要求严格的样品，在取材时一定要严格掌握取材的时间。 （5）、一些塑性大、脆性大的样品，为避免切割造成的损伤，可采取冷冻断裂取材。 3）、样品的清洗 生物的组织器官，它们在体内由于执行不同的生理功能，它们的表面都有不同的污物（如血液、分泌物、粘液等）。为使这样的组织的真面目充分暴露出来，以利于在扫描电镜下观察到真正的表面形貌，就必须进行认真的清洗。根据组织表面的不同污物可采取不同的清洗方法，清洗方法主要有如下几种： （1）、用缓冲液、蒸馏水漂洗或冲洗。这种方法主要适用于组织表面附着的易溶于水的污物或附着不牢固的污物的清洗（如一些动物体表面和植物组织表面的污物）。 （2）、生理盐水清洗。本法主要适用于动物组织的清洗，多数动物组织都可采用这一方法进行清洗，但那些表面结构复杂（主要是凹凸不平）； 组织表面的污物粘附牢固的样品，不能单纯用这种方法进行清洗。 （3）、超声波清洗法。对那些表面污物较多、形态结构复杂的样品，采取一般方法很难清洗干净时，可用本法进行清洗。但是所选用的频率和功率一定要合适，否则，会损伤样品。一般情况下功率用20～25瓦；频率用5000～25000Hz,清洗0.5～15分钟就可以。 （4）、水解蛋白酶清洗法。对组织表面粘附的蛋白类物污，可用适当浓度的相应的水解蛋白酶水溶液清洗。但使用的浓度和清洗的时间要严格掌握。 除上述几种方法外，有时还可以选用吐温－20生理盐水溶液清洗。生物扫描样品的清洗很重要，样品制作时必须认真对待。 2、固定 固定所使用的固定液与透射电镜的相同。一般也是采用戊二醛和锇酸双重固定法。在扫描电镜的生物样品制备技术中，用锇酸