丙型肝炎检测-2017年10月.ppt

丙型肝炎检测 目前丙型肝炎检测; 一、HCV抗体检测 二、HCV抗原检测 三、HCV核酸检测 四、HCV基因型检测 五、HCV细胞培养 丙型肝炎病毒抗体检测 一、抗-HCV检测的目的意义 1、抗-HCV检测可用于诊断、血液筛查、流行病监测等。 2、以诊断为目的的检测是为了确定个体HCV感染状况。 3、以血液筛查为目的的检测是为了防止输血传播HCV，包括献血员筛查和原料血浆筛查。 4、以流行病监测为目的的检测是为了解不同人群HCV感染率及其变化趋势，包括各类高危人群、重点人群和一般人群。 二、抗-HCV检测的方法 抗-HCV检测分为筛查试验（酶联免疫吸附试验、胶体金法快速试验、化学发光试验、免疫荧光试验）和补充试验（免疫印迹试验）。 （一）筛查试验 1、抗-HCV酶联免疫吸附试验 间接法酶联免疫吸附试验是抗-HCV检测常用的筛查方法。其基本原理 是以HCV抗原包被固相载体，用辣根过氧化物酶标记的抗人IgG与被检样品中的抗-HCV反应，以邻苯二胺（OPD）或3，3‘，5，5’—四甲基联苯胺 （TMB）等底物显色后，利用酶标仪等仪器进行阴阳性结果判断。其主要 反应过程如下：加入经样本稀释液稀释的被检样品，样品中的抗-HCV与抗原结合，形成固相抗原抗体复合物；固相载体上只留下抗-HCV，其他免疫球蛋白及样品中的杂质由于不能与固相抗原结合，在洗涤过程中被洗去；加酶标抗抗体与固相复合物中的抗体结合，从而使该抗体间接地标记上酶；洗涤后，固相载体上的酶量就显示特异性抗体的量；加底物显色及终止液，利用酶标仪等仪器分析结果。 2、化学发光试验 化学发光免疫分析（CLIA）是将具有高度敏度的化学发光测定技术与高特异性的免疫反应相结合，用于各种抗原、半抗原、抗体、激素酶、脂肪酸、维生素和药物等的检测分析技术。化学发光免疫分析法以标记方法的不同而分为两种： （1） 化学发光标记免疫分析法：化学发光标记免疫分析又称化学发光免疫分析（CLIA)，是用化学发光剂直接标记抗原或抗体的免疫分析法。常用于标记的化学发光物质有吖啶酯类化合物，是有效的发光标记物，通过起动发光试剂作用而发光，强烈的直接发光在一秒钟内完成，为快速的闪烁发光。吖啶酯作为标记物用于免疫分析，其化学反应简单、快速、无须催化剂；检测小分子抗原采用竞争法，大分子抗原则采用夹心法，非特异性结合少，本底低；与大分子的结合不会减少所产生的光量，从而增加灵敏度。 （2） 化学发光酶免疫分析法：从标记免疫分析角度，化学发光酶免疫分析（CLEIA)应属酶免疫分析，只是反应的底物是发光剂，操作步骤与ELISA分析完全相同。以酶标记生物活性物质（如酶标记的抗原或抗体）进行免疫反应，免疫反应复合物上的酶再作用于发光底物，在信号试剂作用下发光，用发光信号测定仪进行发光测定。该方法又分为如下几类： ① HRP （辣根过氧化物酶）标记的CLEIA：常用的底物为鲁米诺或其衍生物如异鲁米诺。是一类重要的发光试剂。鲁米诺的氧化反应在碱性缓冲液中进行，在过氧化物酶及活性氧（过氧化阴离子O2-，单线态氧O2，羟自由基OH-，过氧化氢H2O2)存在下生成激发态中间体，当其回到基态时发光，其波长为425nm。早期用鲁米诺直接标记抗原或抗体，但标记后发光强度降低而使灵敏度收到影响。近来用过氧化物酶标记抗体，进行免疫反应后利用鲁米诺作为发光底物，在过氧化物酶和起动发光试剂（NaOH2H2O2）作用下，鲁米诺发光，发光强度依赖于酶免疫反应物中酶的浓度。 ② 增强发光酶免疫分析（enhanced luminescence enzyme immunoassayELEIA）在发光系统中加入增强发光剂以增强发光信号， 并在较长时间内保持稳定， 便于重复测量， 从而提高分析灵敏度和准确性。 ③ ALP（辣根过氧化物酶）标记的CLEIA 所用底物为环1，22二氧乙烷衍生物，用于化学发光酶免分析底物而 设计的分子结构中包含起稳定作用的基团—金刚烷基，其分子中发光基团 为芳香基团和酶作用的基团，在酶及起动发光试剂作用下引起化学发光。 3 胶体金法快速试验 （1） 免疫渗滤试验：斑点免疫胶体金快速试验以硝酸纤维膜为载体， HCV抗原点状固定在膜上，加待检样品。阳性结果在膜上抗原部位显示出有色斑点。反应时间在10分钟以内。有效试验的质控点必须显色。 （2）免疫层析试验：以硝酸纤维膜为载体，HCV抗原线状固定在膜 上，待检样品沿着固相载体迁移，阳性结果在膜上抗原部位显示出有色条带。有效试验的质控线必须显色。 （二）抗体补充试验 抗体补充试验目前常用的为免疫印迹试验。