中国对虾淋巴组织培养中的病毒 及病理观察.PDFVIP

　第23 卷第2 期 水　产　学　报 Vol.23, No.2　 1999 年6 月　　　 　　　　　　JOURNAL OF FISH RI S OF CHINA　　　　　　　　　 June, 1999　 中国对虾淋巴组织培养中的病毒 及病理观察 1 2 2 苗宏志　童裳亮　徐　斌 　姜　明 　刘晓云 (青岛海洋大学海洋生命学院, 　266003) 1 (青岛海洋大学水产学院, 　266003) 2 (青岛海洋大学测试中心, 　266003) 　　摘　要　　通过对中国对虾的淋巴器官和经过培养的养殖、海捕中国对虾的淋巴组织细胞进 行电镜观察, 均发现在细胞内存在一种形状为球形, 有囊膜, 平均直径为136nm 的病毒, 病毒分 布于细胞质内, 或成团存在, 似为一种虹彩病毒;在养殖对虾淋巴器官及培养过的组织细胞中还 发现另一种病毒, 病毒粒子为正二十面体, 无囊膜, 平均直径为33nm, 分布于细胞质中, 似为一 种小RNA 病毒。在体外培养淋巴组织过程中, 病毒在细胞内没有明显增殖迹象。感染病毒的细胞 呈现细胞核固缩, 细胞质空泡化, 线粒体内嵴模糊, 粗面内质网水肿等一系列病理变化。对淋巴 组织切片进行光镜观察, 发现淋巴器官组织部分坏死, 有些细胞核肿大, 苏木精深染, 严重的细 胞核结构已经被破坏。 关键词　　中国对虾, 淋巴组织培养, 虹彩病毒, 小RNA 病毒 　　从1993年起, 我们一直进行对虾的组织培养研究, 并已取得重要进展[Tong 和Miao 1996]。在实验中发现, 无论人工养殖的还是海捕的对虾, 表面看来很健康, 但有些个体其淋 巴器官却有些水肿现象。在组织培养过程中, 发现有些淋巴器官的迁出细胞出现空泡。由此 推断, 外表健康的对虾也可能有病毒感染。为此, 我们对健康对虾的淋巴器官进行组织病理 学切片, 并对淋巴器官及体外培养的淋巴组织细胞进行电镜观察。结果发现, 养殖和海捕对 虾的健康个体其淋巴组织及人工培养的细胞都不同程度地受病毒感染。 1　材料与方法 1.1　材料 所用对虾为中国对虾(Penaeus chinensis )。于1995、1996年的9 ～10 月采自青岛地区对虾养 殖场或市售海捕活对虾。养殖对虾体长9 ～10cm, 海捕对虾15 ～20cm。 1.2　方法 1.2 .1 　淋巴器官的组织培养 组织培养方法按Tong 和Miao[1996]方法进行。将对虾放于5%的次氯酸钠中消毒 1～2 国家攀登计划B 资助项目(海洋生物优 研究),PDB 6-6-1 号 收稿日期:1997-09-12 170 水　产　学　报　　　　　　　　　　　　　　　　　23 卷 分钟, 再用70%的酒精进一步对体表消毒, 在无菌条件下摘取淋巴器官, 放入自制对虾细胞 培养基(Medium of Penaeid Shrimp,MPS)。培养基内含青霉素200IU/mL 和链霉素200 μg/mL。 3 2 将组织剪碎成1mm 左右的碎块, 置入25cm 进口塑料细胞培养瓶内, 并加入MPS 生长培养 基, 在25℃培养箱中培养。每4 ～5 天换一次培养液, 每天观察细胞生长状况。 1.2 .2 　培养细胞超薄切片的制备 用细胞刮刀将培养的对虾淋巴组织细胞刮下, 连同培养液一起注入离心管中, 用1000 r/min离心分离细胞10 分钟, 再用PBS(pH7.2)洗三次。所得细胞用4 ℃的2%戊二醛固定2 次, 每次50 分钟。用2.5%磷酸盐缓冲液(pH7.0)漂洗三次后再用锇酸固定、梯度乙醇脱水、 pso