实验八、植物组织中超氧物歧化酶的提取及酶活性测定.pptVIP

实验七、植物组织中超氧化物歧化酶的提取及活性测定 一、实验目的 掌握SOD酶的提取方法及原理 掌握氮蓝四唑（NBT）法测定SOD酶活性。 超氧化物歧化酶（SuperoxideDismutase，EC1.15.1.1，简称SOD）是一种具有抗氧化、抗衰老、抗辐射和消炎作用的药用酶，能清除体内有氧代谢产生的超氧阴离子（O2·-）；是生物体防御氧化损伤的重要金属酶类，对机体的细胞具有保护作用。 动植物及微生物细胞中含有较丰富的SOD，通过组织或细胞破碎后，可用pH7.8磷酸缓冲液提取出。 在有氧化物质存在下，核黄素可被光还原，被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生O2，可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲腙，后者在560nm处有最大吸收。而SOD可清除O2，从而抑制了甲腙的形成。于是光还原反应后，反应液蓝色愈深，说明酶活性愈低，反之酶活性愈高。据此可以计算出酶活性大小。 三、实验材料、仪器及试剂 1 材料：植物叶片（去叶脉） 2 仪器设备：高速台式离心机；研钵；分光光度计；荧光灯（反应试管处照度为4000Lx）；试管数支 3 试剂： 130mmol/L 甲硫氨酸（Met）溶液：称1.9399gMet用磷酸缓冲液定容至100ml； 3.750μmol/L 氮蓝四唑溶液：称取0.06133gNBT用磷酸缓冲液定容至100ml，避光保存； 100μmol/L EDTA-Na2溶液：称取0.03721gEDTA－Na2用磷酸缓冲液定容至1000ml； 20μmol/L 核黄素溶液（维生素B2）：称取0.0753g核黄素用蒸馏水定容至1000ml避光保存。 NBT反应液：将上述四种溶液等量混匀，避光保存 0.05mol/L 磷酸缓冲液（pH7.8）； 四、 实验步骤 1. SOD酶的粗提 取新鲜植物叶片，冲洗干净，吸干表面水分，去掉叶脉，称取1.0~2.0g于预冷的研钵中， 加入1ml预冷的0.05mol／L磷酸缓冲液(pH7.8) ，进行组织细胞破碎，使SOD充分溶解到缓冲液中，然后加缓冲液使终体积为5ml，在5000r／min下离心15min，得到的上清液为粗酶液。 四、 实验步骤 2.SOD酶活力的测定 取10mL试管4支，2支为测定管，另2支为对照管，按表1加入各溶液。 混匀后，给1支对照管罩上比试管稍长的双层黑色硬纸套遮光，与其他各管同时置于4000lx日光灯下反应10min(要求各管照光情况一致，反应温度控制在25～35℃之间，使酶活性高低适当调整反应时间)。 反应结束后，以不照光的对照管做空白，分别测定其它各管的吸光度。 五、实验结果计算 酶活单位定义： 每毫克鲜重在1ml反应液中SOD抑制率达50%时所对应的SOD量为一个SOD活力单位（U）。 六、注意事项 冰上充分碾磨，使细胞壁破碎 七、思考题 1、在SOD测定中为什么设暗中和照光两个对照管？ 2、影响本实验准确性的主要因素是什么？应如何克服？ * * 二、实验原理 因此光还原反应后，反应液蓝色愈深说明酶活性愈低，反之酶活性愈高。 本实验依据超氧物歧化酶抑制氮蓝四唑（NBT）在光照下的还原作用来确定酶活性大小。 核黄素 光照、被氧化物质 还原的核黄素 氧 氮蓝四唑 蓝色的化合物甲腙 （560nm） 2 + 2H+ H2O2 + O2 SOD 用量(ml) 试 剂（酶） 6.0 总体积 0.4 蒸馏水 0.1 酶液（实验管）/缓冲液（对照管） 2.4 NBT反应液 3 0.05mol/L磷酸缓冲液 表1 各溶液加入量 SOD总活性 = u/g(FW)= 单位：酶单位/g鲜重表示； Ack —照光对照管的光密度值； AE —样品管的光密度值； V —样液总体积（ml）； a —测定时样品用量（ml）； W —样重（g）； *