植物组织培养六.pptVIP

§1.单细胞分离 无论何种细胞同步化处理，对细胞本身或多或少都有一定的伤害。如果处理的细胞没有足够的生活力，不仅不能获得理想的同步化效果，还可能造成细胞的大量死亡，因此在进行同步化处理之前，细胞必须进行充分的活化培养。用于处理的细胞系最好处于对数生长期。 3、微室培养概念：人工制造一个小室，将单细胞培养在小室中的少量培养基上，使其分裂增殖形成细胞团的方法，称微室培养。 1. 植物产生代谢产物的类型 植物次生产物种类繁多（据保守估计已超过2万种），根据分子结构不同大致分为： 酚类化合物－黄酮类 单酚类 醌 类（苯醌、萘醌、蒽醌） 萜类化合物－三萜皂甙 甾体皂甙 单萜、倍半萜、二萜 含氮化合物－生物碱（真生物碱、伪生物碱、原生物碱） 胺类（伯、仲、叔、季胺） 非蛋白质氨基酸 多炔类、有机酸等 5)具有群体效应；6)因为有细胞壁, 培养细胞产物滞留于细胞内，产量较低；7)细胞培养过程具有结构与功能全能性,因而易分化,从而导致目的产物低于原植物体内的浓度；8)悬浮培养中要求有一定的细胞浓度，否则不生长（25000~50000个/ml）。 二.培养系统 机械搅拌式培养系统 平床培养系统。本系统由培养、液罐和动泵等构成。新鲜的细胞被固定在床底部由聚屏烯等材料编织成的无菌平垫上。无菌液罐被紧固定在培养床的上方，通过管道向下滴注培养液。培养床上的营养液再通过动泵循环送回中，本系统设备较简单，比悬浮培养体系能更有效地合成次生物质。不过它占地面积大，累积次生代谢物较多的滴液区所占比例不高；而且在这密封的体系中氧气的供应时常成为限制因子，经常还得附加提供无菌空气的设备。 2、选择适宜的起始材料首先必须选择能够高效合成目的产物的植物种类。再此前提下，起始培养材料还应考虑器官和组织特异性，通常选取自然状态下能够积累次生产物的部位，这样的细胞经过培养后常具有合成目的产物的能力，或比较容易诱导合成目的产物。同时要筛选高产、稳产的细胞株系。 2.优良细胞系的增殖培养 ?所选择的优良细胞系，进行大规模繁殖，得到足够的细胞是建立细胞规模化培养体系的中间环节。 3.大规模培养体系的建立 一步法逐级放大：对于细胞生长与目的产物合成同步的类型，一般采用此方法建立大规模培养系统。 两步法：用于目的产物合成在细胞生长发育到一定时期进行，细胞生长和产物合成需要不同的培养基的类型。先在细胞生长培养基中培养大批量细胞，当细胞生长至合成产物的阶段后，再将其转入到产物合成培养基中培养。 如果采用固相培养方式生产次生产物，一般均需采用两步法建立体系。 四.提高细胞次生代谢产物的途径 1．明确植物细胞生长与产物合成的关系 生长偶联型 产物合成与细胞生长成正比。如长春花属植物中的长春花碱的合成、烟草细胞的烟碱合成、薯蓣属植物中的薯蓣皂甙的合成等； 中间型 产物仅在细胞生长下降时合成，细胞处于指数生长期或停止生长产物都不合成。蒽醌类物质合成的植物细胞，托品类生物碱类合成的植物细胞等属于此类型； 非生长偶联型 产物合成在细胞生长停止以后。如紫草宁的合成。 3、选择合适的培养基成分一般来说，增加培养基的N，P、K的浓度能促进细胞生长，而适当增加糖浓度有利于次生产物的合成。培养基的成分包括培养条件要通过一定的实验才能选择出既有利于细胞大量生长繁殖又有利于次生代谢产物大量产生的培养基。 4、前体 植物培养细胞具有能将有机化合物进行化学转化的巨大潜力，这些化学反应包括皂化、酯化、醛基化、羧基化、异构化、甲基化及双键还原等。因此可在培养基中加入适当的进行上述化学反应的前体，便有可能为我们得到需要的化学转达化目的产物。 5、激发子的应用植物细胞次生代谢除了自身的遗传或发育基础外，通常还与诱导因子有关。在一些不良环境或有微生物侵入的情况下，细胞次生代谢活动显著增强。因此，人为合理的应用这些诱导因子，就有可能提高目的产物的产量。激发子也称诱导子，是指能够诱导植物细胞中一个反应，并形成细胞特征性自身防御反应的分子。A、非生物激发子，如辐射、金属离子等B、生物激发子，（外源激发子，多来源于微生物，内源激发子，来源于植物本身的物质，如降解细胞壁的酶类，细胞碎片、寡聚糖等。 2）抑制剂法 通过一些DNA 合成抑制剂处理细胞，使细胞停留在DNA 合成前期，当解除抑制后，即可获得处于同一细胞周期的细胞。 常用的抑制剂有5-氟脱氧尿苷，5-氨基尿嘧啶、羟基尿等。3）有丝分裂阻抑 用秋水仙素处理指数生长的悬浮培养物，浓度一般控制在0.2%，处理时间以4-6小时为宜 §3.单细胞培养技术一、植物单细胞培养的意义1、建立单细胞无性系 悬浮培