补体成分C3及其缺失突变体蛋白的表达及与-安徽医科大学学报.PDF

安徽医科大学学报　ＡｃｔａＵｎｉｖｅｒｓｉｔａｔｉｓＭｅｄｉｃｉｎａｌｉｓＡｎｈｕｉ　２０１５Ｎｏｖ；５０（１１） ·１５３３· 补体成分 Ｃ３及其缺失突变体蛋白的表达及 与ＣＬＩＣ１蛋白共定位的研究 王二宁，陈丹丹，刘晓颖，范礼斌 摘要　目的　研究补体成分 Ｃ３及其缺失突变体 Ｃ３（１ 统的有关成分如 Ｃ３和Ｂ因子，同时也能检测出补 ８４０）、Ｃ３（８２４１６６３）在真核细胞内的表达及与氯离子通道蛋 ［４］ 体活性 。因此，补体作为独立的先天性免疫防御 白（ＣＬＩＣ１）的共定位。方法　构建 ｐｃＤＮＡ３１Ｃ３ＦＬＡＧ、 机制，出现远远早于特异性免疫，表明补体系统在进 ｐｃＤＮＡ３１Ｃ３（１８４０）ＦＬＡＧ、ｐｃＤＮＡ３１Ｃ３（８２４１６６３） 化起源上比较早［５－６］。无论是先天性还是特异性的 ＦＬＡＧ三个真核表达质粒（缺失突变体根据 Ｃ３的结构域及 免疫都是无可替代的。 其裂解断裂位置设计），并分别转染至 ＨＥＫ２９３Ｔ细胞中， 该研究通过构建下游带有ＦＬＡＧ标签的真核表 Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测表达情况；上述质粒分别瞬时单转至ＣＯＳ７ 达质粒即 ｐｃＤＮＡ３１Ｃ３ＦＬＡＧ、ｐｃＤＮＡ３１Ｃ３（１ 细胞和分别与ＧＦＰＣＬＩＣ１共转至ＣＯＳ７细胞内，观察共定位 情况。结果　成功构建带ＦＬＡＧ标签的Ｃ３基因及其两个缺 ８４０）ＦＬＡＧ、ｐｃＤＮＡ３１Ｃ３（８２４１６６３）ＦＬＡＧ，然后 失突变体［Ｃ３（１８４０）、Ｃ３（８２４１６６３）］的真核表达载体， 分别转染至ＨＥＫ２９３Ｔ和ＣＯＳ７细胞中，来研究其在 Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ结果显示它们在 ＨＥＫ２９３Ｔ细胞中均能成功表 真核细胞内的表达及其和氯离子通道蛋白（ＣＬＩＣ１） 达；免疫荧光显示它们在 ＣＯＳ７细胞中均主要分布于细胞 的共定位情况。 质，且三个真核表达载体中只有 Ｃ３（８２４１６６３）与 ＣＬＩＣ１有 １　材料与方法 共定位。结论　补体 Ｃ３及其缺失突变体 Ｃ３（１８４０）和Ｃ３ （８２４１６６３）在ＨＥＫ２９３Ｔ、ＣＯＳ７细胞中均能高效表达，且主 １．１　质粒、菌株和细胞　含人 Ｃ３全长ｃＤＮＡ序列 要分布在细胞质内，Ｃ３（８２４１６６３）与ＣＬＩＣ１蛋白有共定位。 的质粒由韩家淮教授实验室惠赠，ｐｃＤＮＡ３１（＋） 关键词　Ｃ３；转染；基因表达；定位 真核表达载体、ＴＧ１感受态菌株、ＣＯＳ７和ＨＥＫ２９３Ｔ 中图分类号　Ｑ２８；Ｒ３９２７ 细胞株均由本实验室－８０℃保存。 文献标志码 Ａ 文章编号 １０００－１４９２（２０１５）１１－１５３３－０５ １．２　主要试剂与仪器　引物合成由上海生工生物 有限公司完成， 　　补体是存在于血清及组织液中的一组具有酶活 ＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ酶（日本ＴａＫａＲａ公 性的球蛋白，主要是由巨噬细胞、单核细胞、淋巴细 司），ＡｘｙＰｒｅｐＤＮＡＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔ（美国Ａｘｙｇｅｎ ［１］ 公司），Ｈｉｎｄ 、Ｘｈｏ 、ＥｃｏＲ 、ＥｃｏＲ 限制性内 胞、骨髓、腹膜和肝脏等合成的一种 球蛋白 。 Ⅲ Ⅰ Ⅰ