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页） 课题 第二章 细胞破碎与固液初级分离技术 教学要求与目标 目标：1、细胞破碎细胞破碎固液初级分离固液初级分离技术固液初级分离影响液一固分离的因素细胞破碎影响液一固分离的因素 教具与 材料 《生物分离技术》杨昌鹏、张爱华主编 教学内容与设计： 教学目标：学会细胞破碎及固液初级分离技术操作。 知识内容：1.细胞破碎的各种方法 2.固液初 级分离技术 实验项目：细胞破碎及密度梯度离心 教学提示：细胞破碎及固液初级分离技术是生化产品制备最初涉及的分离技术。 组织教学：点名、检查学生的出勤情况 2min 导入新课:细胞破碎有几种方法,各自有什么特点 1min 第二章 细胞破碎与固液初级分离技术 第一节 细胞破碎技术 阐述细胞破碎技术的含义及各种细胞壁的特点 一、机械法利用玻璃小珠与细胞悬液一起搅拌，适用于酵母菌、大肠杆菌、巨大芽孢杆菌和黑曲霉等。 黑龙江生物科技职业学院教案（第 页） 教学内容与设计： 一般认为超声波破碎的机理是：在超声波作用下液体发生空化作用，空穴的形成、增大和闭合产生极大的冲击波和剪切力，使细胞破碎。超声波破碎法是很强烈的破碎方法，适用于多数微生物的破碎。超声波破碎法的有效能量利用率极低，操作过程产生大量的热，因此操作需在冰水或有外部冷却的容器中进行。由于对冷却的要求相当苛刻，所以不易放大，主要用于实验室规模的细胞破碎。 二、非机械法 22min （一）冻结-融化法 将细胞急剧冻结后在室温缓慢融化，此冻结一融化操作反复进行多次，使细胞受到破坏。 冻结的作用是破坏细胞膜的疏水键结构，增加其亲水性和通透性。另一方面，由于胞内水结晶使胞内外产生溶液浓度差，在渗透压作用下引起细胞膨胀而破裂。冻结一融化法对于存在于细胞质周围靠近细胞膜的胞内产物释放较为有效，但溶质靠分子扩散释放出来，速度缓慢。因此，冻结-融化法在多数情况下效果不显著。 （二）渗透压冲击法 渗透压冲击是各种细胞破碎法中最为温和的一种，适用于易于破碎的细胞，如动物细胞和革兰氏阴性菌。 将细胞置于高渗透压的介质（如较高浓度的甘油或蔗糖溶液）中，达到平衡后，将介质突然稀释或将细胞转置于低渗透压的水或缓冲溶液中。在渗透压的作用下，水渗透通过细胞壁和膜进人细胞，使细胞壁和膜膨胀破裂。 （三）有机溶剂法 有机溶剂（如胍、乙醇、尿素和异丙醇等）可以削弱疏水分子间的相互作用。异丙醇广泛应用于从酵母中分离蛋白酶的细胞破碎工艺中。尽管有机溶剂可以用于任何规模的细胞破碎，但在使用中高浓度的有机溶剂使很多蛋白质（如酶）失活，不适合大规模的生产工艺。 有机溶剂被细胞壁吸收后，会使细胞壁膨胀或溶解，导致破裂，把细胞内产物释放到水相中去。选用溶剂的基本原则是，以与细胞壁中脂质类似的溶解度参数的溶剂作为细胞破碎的溶剂。 （四）表面活性剂法 表面活性剂是指不仅能溶于水或其他有机溶剂，同时又能在相界面上定向并改变界面性质的某些有机化合物。表面活性剂分子中同时具有憎水基团和亲水基团，当表面活性剂溶质或溶剂中的浓度达到一定时，它的分子会产生凝聚，生成胶束，憎水端向内，亲水端向外。憎水基团聚集在胶束内部，将溶解的脂蛋白包在中心，而亲水基团则向外层，使膜的通透性改变或使细胞壁溶解，从而使胞内物质释放到水相中。 （五）酸碱法 蛋白质为两性电解质，改变pH可改变其荷电性质，使蛋白质之间或蛋白质与其他物质之间的相互作用力降低而易于溶解。因此，利用酸碱调节pH值， 教学提示 注意必须进行冷却，很重要 主板书 副板书 副板书 副板书 提问：为什么能够用有机溶剂溶解？ 副板书 副板书 黑龙江生物科技职业学院教案（第 页） 教学内容与设计： 可提高目标产物溶解度。 （六）酶溶法 利用溶解细胞壁的酶处理菌体细胞，使细胞壁受到部分或完全破坏后，再利用渗透压冲击等方法破坏细胞膜，进一步增大胞内产物的通透性。 第二节 固液初级分离技术一、离心分离技术 黑龙江生物科技职业学院教案（第 页） 教学内容与设计： （2）离心机附件 ① 离心管② 密度梯度离心附件③ 区带离心附件 ④ 分析附件 3、 离心机操作的注意事项 （1）使用各种离心机时，必须事先在天平上精密地平衡离心管和其内容物。 （2）装载溶液时，要根据各种离心机的具体操作说明进行，根据待离心液体的性质及体积选用适合的离心管。 （3）若要在低于室温的温度下离心时。转头在使用前应放置在冰箱或置于离心机的转头室内预冷。 （4）离心过程中不得随意