一个gap启动子的分析及点突变体构建.pdfVIP

第３３卷第６期 重庆工商大学学报（自然科学版） ２０１６年１２月 Ｖｏｌ．３３　 ＮＯ．６ 　 　 　 　 　 　 　 　 Ｊ Ｃｈｏｎｇｑｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｕｓｉｎｅｓｓ Ｕｎｉｖ（Ｎａｔ Ｓｃｉ Ｅｄ）　 　 　 　 　 　 　 　 Ｄｅｃ．２０１６ － ｄｏｉ：１０．１６０５５／ ｊ．ｉｓｓｎ．１６７２ ０５８Ｘ．２０１６．０００６．０２３ 一个 ＧＡＰ 启动子的分析及点突变体构建∗ 孙雪娇，李昭洋，李　 兵，孙忠科∗∗ （周口师范学院生命科学与农学学院，河南 周口４６６００１） 　 　 摘　 要：甘油醛⁃３⁃磷酸脱氢酶基因（ＧＡＰ）作为常见的持家基因在微生物中普遍表达，因而其启动子 （ＰＧＡＰ）被认为是一个强的组成型启动子；首先，预测并克隆了双叉双歧杆菌的ＧＡＰ 启动子，并利用葡萄糖 醛酸苷酶基因为报告基因，分析了ＰＧＡＰ 在大肠杆菌和双歧杆菌中驱动表达的强度；不同碳源的发酵实验表 明：ＰＧＡＰ 在葡萄糖培养基中强度最高，而３种底物类似物对ＰＧＡＰ 强度的影响各不相同；对ＰＧＡＰ 预测的⁃ １０ 区进行了系列点突变，具有更接近ｓｉｇｍａ７０启动子共有序列的突变体ｐＭＧＡＰ３表现出更高的驱动强度； 最后，通过对代表性双歧杆菌ＰＧＡＰ 序列的比对，表明在一些核心区域，如可能的ＴＡＴＡ 盒、转录起始位点、 核糖体结合位点高度保守。 关键词：ＧＡＰ；启动子；双歧杆菌；点突变 － 中图分类号：Ｑ８１２　 　 　 文献标志码：Ａ　 　 　 文章编号：１６７２ ０５８Ｘ（２０１６）０６⁃０１１７⁃０７ 　 　 作为人体肠道主要的生理性细菌，双歧杆菌被 高强度的ＧＡＰ 启动子。 因此，以ＣＩＣＣ ６０７１为模 ［１］ 板，分析并扩增了双叉双歧杆菌的一个新ＧＡＰ 启动 报道具有多种促进健康的功能 。 双歧杆菌在食 － 品和医药工业中具有很大的应用前景，利用他们作 子。 同时，研究了碳源和底物类似物，以及 １０ 区序 为发酵剂、或者药物转运载体，人类可以应对很多 列对ＰＧＡＰ 强度的影响。 最后，考虑到ＧＡＰ 基因的 危险疾病的威胁，如癌症的靶向治疗和糖尿病的饮 保守性，对代表性的ＰＧＡＰ序列进行了比对。 ［２⁃４］ 食治疗 。 双歧杆菌要作为药物转运载体，必须 具有高效的外源表达系统。 但是，到目前为止，有 １　 材料与方法 效的双歧杆菌表达系统很少，这主要是因为缺少有 ［５⁃６］ 效的分子工具以及其对基因修饰的自然抗性 。 １．１　 菌株、质粒及引物的生长条件 对调控细菌的基因表达，启动子起着至关重要的作 大肠杆菌（Ｅ． ｃｏｌｉ ＤＨ１０Ｂ）用于克隆和常规操 用。 因此，筛选强度高并且受调控的启动子对高效 作，３７ ℃ 培养于 ＬＢ 培养基。 双叉双歧杆菌 ［７］ 外源表达系统仍然是必要的 。 从转录组数据可 Ｂ． ｂｉｆｉｄｕｍ ＣＩＣＣ ６０７１（ＡＴＣＣ ２９５２１）用于模板制备 知，长双歧杆菌ＮＣＣ２７０５持家基因甘油醛⁃３⁃磷酸脱 和表达宿主，培养于添加 ０．５ ｇ／ Ｌ Ｌ⁃半胱氨酸的 氢酶基因（ＧＡＰ）高表达，并且其启动子ＰＧＡＰ 可以 ＭＲＳ（ＯＸＯＩＤ）培养基。 培养条件为３７ ℃静置４８ｈ，