表皮生长因子受体酪氨酸激酶的克隆表达和酶抑制剂筛选模型的构建.pdfVIP

中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００８，２８（１０）：１２～１７ 檪檪檪檪檪檪檪檪殏 檪 殏 殏檪檪 研究报告殏檪 檪檪檪檪檪檪檪檪 表皮生长因子受体酪氨酸激酶的克隆表达和 酶抑制剂筛选模型的构建 张　洋　刘春平　李　元 （中国医学科学院中国协和医科大学医药生物技术研究所　卫生部抗生素生物工程重点实验室　北京　１０００５０） 摘要　表皮生长因子受体（ｅｐｉｄｅｒｍａｌｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒｒｅｃｅｐｔｏｒ，ＥＧＦＲ）属受体酪氨酸激酶（ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ，ＴＫ）家族，其胞内的酪氨酸激酶在细胞信号转导通路中具有十分重要的作用。许多肿瘤的 发生、发展都与ＥＧＦＲ胞内酪氨酸激酶的异常表达密切相关。因此，ＥＧＦＲ胞内酪氨酸激酶的抑 制剂有可能成为治疗肿瘤的有效药物。从人脐静脉内皮细胞（ＨＵＶＥＣ）提取总ＲＮＡ，采用ＲＴ ＰＣＲ获得ＥＧＦＲ酪氨酸激酶催化域的编码基因。将其克隆至载体ｐＥＴ３０ａ，在Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３） 中进行了成功表达，采用ＮｉＮＴＡ亲和层析对其进行了纯化。通过对酶的活性的测定，证明重组 ＥＧＦＲ酪氨酸激酶蛋白具有利用ＡＴＰ催化底物发生磷酸化反应的激酶活性。以该重组激酶为靶 位构建了酶抑制剂筛选模型，拟对微生物代谢产物进行筛选。 关键词　ＥＧＦＲ酪氨酸激酶　克隆表达　重组蛋白　抑制剂筛选模型 中图分类号　Ｑ７８６ 　　ＥＧＦＲ广泛分布于哺乳动物的上皮细胞、人的成纤 　　本研究将人源 ＥＧＦＲ酪氨酸激酶催化域在Ｅ．ｏｌｉ 维细胞、胶质细胞、角质细胞等，并在多种上皮肿瘤细 ＢＬ２１（ＤＥ３）中成功进行了表达，采用ＮｉＮＴＡ亲和层析 ［１］ 对蛋白进行了纯化，并对重组蛋白的酪氨酸激酶活性 胞中过度表达 。ＥＧＦＲ高表达的肿瘤患者，肿瘤恶性 ［２］ 进行了优化条件研究，以其为靶点构建了酶抑制剂筛 程度高，患者存活期短 。人的ＥＧＦＲ基因定位于第７ 号染色体的短臂（７ｐ１２．３ｐ１２．１），它的编码产物由 选模型，对微生物产物进行筛选，为抗肿瘤新药的研制 １２１０个氨基酸组成，是一种分子量约为１７０ｋＤａ的糖蛋 奠定了一定基础。 ［３］ 白，由胞外结构域、跨膜区及胞内结构域组成 ，其中 １　材料与方法 ［４］ ７１２～９７９位氨基酸属于酪氨酸激酶区 。ＥＧＦＲ酪氨 酸激酶能催化ＡＴＰ的 磷酸基团转移至许多重要蛋白 １．１　材　料 γ ［５］ １．１．１　质粒、菌株和细胞株　质粒ｐＥＴ３０ａ及大肠杆 质的酪氨酸残基上 ，使其发生磷酸化，进而导致信号 的传导级联。据了解５０％以上的原癌基因和癌基因产 菌ＢＬ２１（ＤＥ３）由本室保存，ＨＵＶＥＣ细胞由本所肿瘤室 物都具有蛋白酪氨酸激酶活性，它们的异常表达导致 保存。 细胞增殖调节发生紊乱，进而促使肿瘤发生［６］。因此， １．１．２　酶与主要试剂　限制性内切酶、Ｔ４ＤＮＡ连接 ｐｆｕＤＮＡ聚合酶购自Ｐｒｏｍｅｇａ或 ＴａＫａＲａ公司；抗 以ＥＧＦＲＴＫ为靶位进行药物设计和筛选可能成为肿 酶、 瘤治疗的有效途径之一。 Ｈｉｓｔａｇ的单克隆抗体、磷酸化的酪氨酸单克隆抗体购 于Ｓａｎｔａｃｒｕｎｚ公司；山羊抗小鼠碱性磷酸酶标记的二 收稿日期：２００８０６２４　　修回日期：２００８０８０４ 国家“８６３”计划（２００４ＡＡ２Ｚ３７８４）资助项目