褐飞虱细胞色素p450基因cyp4c62的原核表达及多克隆-昆虫学报.pdfVIP

： 昆虫 学 报ＡｃｔａＥｎｔｏｍｏｌｏｇｉｃａＳｉｎｉｃａ，Ｊｕｎｅ２０１４，５７（６）６５６－６６２ ＩＳＳＮ０４５４６２９６ 褐飞虱细胞色素Ｐ４５０基因ＣＹＰ４Ｃ６２的 原核表达及多克隆抗体的制备 １ ２ １， 孙海霞 ，陈　俊 ，杨之帆 （１．湖北大学生命科学学院，生物资源绿色转化湖北省协同创新中心，武汉４３００６２； ２．武汉科技大学化学工程与技术学院，武汉４３００８１） 摘要：【目的】细胞色素Ｐ４５０单加氧酶在昆虫生长发育和适应环境过程中发挥着重要功能。【方法】本研究克隆了褐 飞虱Ｎｉｌａｐａｒｖａｔａｌｕｇｅｎｓ细胞色素 Ｐ４５０基因ＣＹＰ４Ｃ６２的开放阅读框（不含信号肽编码序列部分），在大肠杆菌 Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ中实现了高效表达，经ＮｉＮＴＡ琼脂糖凝胶亲和层析柱纯化得到了重组的ＣＹＰ４Ｃ６２蛋白。将该蛋白免 疫日本大耳白兔Ｏｒｙｃｔｏｌａｇｕｓｃｕｎｉｃｕｌｕｓ雄兔，制备了兔抗ＣＹＰ４Ｃ６２血清抗体。采用间接ＥＬＩＳＡ方法检测了血清抗体的 效价；并通过Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹杂交检测了该抗体的免疫学特异性。【结果】结果表明，通过大肠杆菌表达出的ＣＹＰ４Ｃ６２ 蛋白相对分子量为５６ｋＤ。间接ＥＬＩＳＡ法检测表明，制备的兔抗ＣＹＰ４Ｃ６２抗体的效价达到１∶１０００００。Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹 杂交证实，该抗体既可与异源表达的ＣＹＰ４Ｃ６２蛋白特异性结合，也可以与褐飞虱总蛋白中内源的ＣＹＰ４Ｃ６２特异性结 合，表明具有较好的免疫反应特异性。【结论】ＣＹＰ４Ｃ６２多克隆抗体的成功制备，为后续分析ＣＹＰ４Ｃ６２在褐飞虱各组织 中的时空表达水平，并通过免疫组织化学法定位分析该蛋白的组织、细胞及亚细胞分布规律，及最终解析ＣＹＰ４Ｃ６２的生 物学功能奠定了基础。 关键词：褐飞虱；细胞色素Ｐ４５０基因；原核表达；蛋白纯化；多克隆抗体；免疫特异性 中图分类号：Ｑ９６６　　文献标识码：Ａ　　文章编号：０４５４６２９６（２０１４）０６０６５６０７ Ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄｐｏｌｙｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｙｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｏｆｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｐ４５０ｇｅｎｅＣＹＰ４Ｃ６２ｆｒｏｍＮｉｌａｐａｒｖａｔａｌｕｇｅｎｓ（Ｈｅｍｉｐｔｅｒａ：Ｄｅｌｐｈａｃｉｄａｅ） １ ２ １， ＳＵＮＨａｉＸｉａ，ＣＨＥＮＪｕｎ，ＹＡＮＧＺｈｉＦａｎ （１．ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ，ＨｕｂｅｉＣｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ ＩｎｎｏｖａｔｉｏｎＣｅｎｔｅｒｆｏｒＧｒｅｅｎＴｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｆＢｉｏＲｅｓｏｕｒｃｅｓ，ＨｕｂｅｉＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｗｕｈａｎ４３００６２，Ｃｈｉｎａ； ２．ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＣｈｅｍｉｃａｌＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＷｕｈａｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｗｕｈａｎ４３００８１，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：【Ａｉｍ】ＴｈｅｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅＰ４５０ｓａｒｅｉｍｐｏｒｔａｎｔｍｅｔａｂｏｌｉｃｅｎｚｙｍｅｓｉｎｉｎｓｅｃｔｓｂｅｃａｕｓｅｏｆｔｈｅｉｒ ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔｉｎｔｈｅｇｒｏｗｔｈａｎｄｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆｉｎｓｅｃｔｓａｎｄｔｈｅｉｒａｄａｐｔａｔｉｏｎｔｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔｓ．【Ｍｅｔｈｏｄｓ】Ｉｎ ｔｈｉｓｓｔｕｄｙ，ｗｅｃｌｏｎｅｄｔｈｅｏｐｅｎｒｅａｄｉｎｇｆｒａｍｅ（ＯＲＦ，ｅｘｃｌｕｄｉｎｇｔｈｅｃｏｄｉｎｇｓｅｑｕｅｎｃｅｆｏｒｔｈｅＮｔｅｒｍｉｎａｌ ｓｉｇｎａｌｐｅｐｔｉｄｅ）ｏｆＮｉｌａｐａｒｖａｔａｌｕｇｅｎｓＰ４５０ｇｅｎｅＣＹＰ４Ｃ６２ａｎｄｅｘｐｒｅｓｓｅｄｉｔｉｎＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ．Ｔｈｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｒｏｔｅｉ